腹膜透析是终末期慢性肾功能衰竭的主要替代治疗方法之一。腹膜纤维化导致的透析效能减退是慢性腹透病人退出的主要原因。腹膜纤维化的发生主要与非生理性的腹膜透析液及代谢产物、反复发作的腹膜炎、细胞因子等有关。 大量研究表明，转化生长因子-β1(TGF-β1)在腹膜纤维化的发生中起中枢作用。但TGF-β1为一多功能细胞因子，效应复杂，完全将其阻断后果难以预料。结缔组织生长因子(CTGF)是介导TGF-β 1促纤维化作用的一个重要下游因子。可调节细胞外基质的生成。由于CTGF主要介导TGF-β1的负面效应，其作用单一，直接抑制CTGF的表达可以避免在上游阻断TGF-β1带来的副作用。因此CTGF可以作为抗腹膜纤维化治疗的新靶点。而RNA干扰技术(RNAi)是基因功能研究中具有广阔应用前景的方法，尤其适合抑制细胞内目标基因的表达。为此，选择RNAi技术作为研究方法之一。 病毒或逆转录病毒载体介导的RNAi转移方法具有转移效率高、长效、适用范围广等优点。pRS载体是由无自身免疫活性的鼠源性干细胞逆转录病毒(pMSCV)，转运含抗嘌呤霉素的pSUPER质粒载体构建成pRETRO-SUPER(pRS)结构。其介导的RNAi技术具有特异性强、转染效率高、对细胞毒性小和作用时间持久等优点。在研究中构建了PRS载体介导的CTGF小分子干扰RNA(siRNA)的逆转录病毒载体，即PRS-CTGF-siRNA载体。并用此载体转染PT-67包装细胞株，进而感染人腹膜间皮细胞(HPMCs)，研究其对于HPMCs的CTGF、VEGF及细胞外基质表达的影响。 目的：利用：PRS逆转录病毒载体介导的表达人CTGF基因小干扰。RNA的逆转录病毒载体(PRS-CTGF-siRNA)转染PT-67包装细胞株，进而感染人腹膜间皮细胞(HPMCs)，研究其对于HPMCs的CTGF、VEGF及细胞外基质表达的影响。 方法：用生物信息学方法找到人CTGF基因最完整的编码序列，按照siRNA序列设计要求，设计4对siRNA靶序列。并根据逆转录病毒载体PRS的特点设计各位点的前体64bpDNA序列，并在体外合成。将体外合成的各位点的64bp正义和反义两条链退火。PRS载体用BglII、HindⅢ双酶切完全后与退火产物进行胶连，16℃连接过夜。连接后去载体自连。将连接产物进行转化，进行酶切鉴定、测序。测序正确的克隆进行大规模培养，用Tipl00抽提质粒，供转染使用。将：PRS-CTGF-siRNA逆转录病毒载体以脂质体2000介导转染PT67细胞。转染后24h后更换完全培养液。转染48h后按1：10传代，加入含2.5μg／ml嘌呤霉素(puromycin)筛选14d，直至抗性细胞集落形成。挑选大的健康的细胞集落，用完全培养液扩大培养，以制备含病毒的包装细胞上清，利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。获得含CTGF-siRNA基因的逆转录病毒上清液，并根据病毒滴度结果选择高滴度病毒上清液稀释后感染HPMCs(加入终浓度4-8ug／ml的多聚季胺)。为了增强感染效率,每隔12小时连续感染靶细胞。感染24小时后,用含0.5ug/ml的puromycin培养基加压筛选,每2天换一次培养液直至对照组细胞全被杀死。继续抗性筛选10～14天,直至克隆形成。挑选健康、大克隆扩大培养进行检测。使用TGF-β1刺激,观察PRS-CTGF-siRNA对TGF-β1刺激下HPMCs的CTGF、VEGF及细胞外基质表达的影响。CTGF、VEGF、FN、ColI、laminin mRNA表达采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)半定量分析。采用Westem-blot方法检测HPMCs中CTGF、VEGF、FN、ColI、laminin蛋白质水平。 结论:体外培养的HPMC可以少量表达CTGF、VEGF及FN、ColI、LN;TGF-β1可明显增加HPMCs细胞内CTGF、VEGF和细胞外基质的表达;PRS-CTGF-siRNA可明显抑制TGF-β1诱导的HPMCs细胞内CTGF、VEGF及细胞外基质的表达。提示PRS-CTGF-siRNA对于腹膜纤维化可能具有潜在治疗价值。并为腹膜纤维化的体内、外研究提供了一种有效途径。