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研究背景周围神经损伤是一种临床常见疾病,由于神经的再生能力差,机体的运动和感觉功能往往不能恢复到正常水平并遗留功能障碍,严重影响患者生活质量。因此,周围神经损伤的再生与修复问题一直以来都是临床和基础研究的热点和难点之一。中药已被证明在神经再生方面具有良好的功效,鹿茸多肽（Velvet antlerpeptide,VAP）作为鹿茸中主要的多肽类活性物质,因具有抗衰老、减少疤痕、调节血管生成等作用被广泛研究。在周围神经系统中,有研究表明VAP可以促进神经再生修复,但是其作用机制和靶点仍不明确。周围神经损伤后,损伤部位及远侧出现“瓦勒氏变性”,轴突髓鞘发生崩解,雪旺细胞（Schwann cells,SCs）通过迁移形成Büngner带为轴突提供再生通道,在周围神经损伤的修复中发挥重要作用。同时,因缺血和炎症导致损伤部位及其远侧的活性氧（ROS）水平显著增加,过量的ROS将导致神经细胞发生氧化应激损伤,细胞功能受损,阻碍周围神经再生。本次研究将探讨VAP对SCs迁移功能的影响,以及在氧化应激状态下对SCs功能的调节作用,进一步深入剖析相关分子生物学机制,从而为周围神经损伤治疗提出新的方法和理论依据。研究目的1.体外实验探究VAP对SCs增殖、迁移的影响和氧化应激下的作用。2.体外实验探究VAP调控SCs迁移的机制。3.通过转录组测序分析解析VAP调控SCs功能的作用机制。4.动物实验进一步验证VAP对周围神经再生的作用及机制。研究方法1.通过CCK-8实验和活/死细胞染色检测不同浓度VAP对SCs增殖功能的影响。2.采用过氧化氢（H2O2）诱导构建氧化应激模型,并运用CCK-8、活性氧荧光探针和活/死细胞染色实验,评估不同浓度VAP在氧化应激条件下,对胞内活性氧的清除能力、以及对SCs的保护作用和增殖的影响。3.通过Transwell实验、结晶紫染色评价不同浓度VAP对SCs迁移功能的影响。4.为研究VAP调控SCs的分子机制,通过使用p38 MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580和PI3K-AKT信号通路特异性抑制剂LY294002分别干预SCs,检测在抑制剂存在的情况下SCs的迁移情况以及不同浓度VAP对SCs迁移的影响。5.通过检测不同浓度VAP对p38 MAPK和PI3K-AKT信号通路激活水平,评估VAP对这两个通路的影响;再使用p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580和PI3K-AKT信号通路抑制剂LY294002处理SCs,研究在通路抑制剂干预的情况下p38 MAPK和PI3K-AKT信号通路的变化情况,以及不同浓度VAP对p38 MAPK和PI3K-AKT信号通路的影响。6.通过western blot和RT-PCR等方法评价VAP对SCs表面神经轴突导向因子Netrin1的受体（UNC5A、UNC5B、UNC5C、UNC5D）蛋白表达水平及mRNA表达的影响,寻找VAP作用的靶点。7.VAP处理SCs后,提取RNA进行转录组测序,根据测序的结果对差异表达的mRNA进行GO分析和KEGG pathway等分析,进一步探究VAP调控SCs迁移的机制。8.构建大鼠坐骨神经损伤模型,通过坐骨神经指数和神经传导速度的检测来评估VAP对坐骨神经功能的恢复情况;运用甲苯胺蓝染色和透射电镜扫描对再生的坐骨神经进行组织学和形态学评估;通过RT-PCR和免疫荧光实验来检测再生神经中相关神经营养因子的表达情况;利用western blot检测再生神经UNC5家族受体、p38 MAPK信号通路和PI3K-AKT信号通路的激活及表达情况。研究结果1.通过CCK-8实验和活/死细胞染色实验,我们发现在非氧化应激状态下用VAP处理SCs,其增殖能力没有明显改变。2.采用过氧化氢（H2O2）诱导构建SCs氧化应激模型后,用不同浓度的VAP处理SCs,并运用CCK-8、活性氧荧光探针和活/死细胞染色实验检测SCs活性以及增殖能力,发现随着VAP浓度增加,相较于阳性对照组,存活的细胞量逐渐增加,并且其增殖能力也随之增加。3.体外实验发现VAP能够促进SCs迁移,40 μg/ml VAP的促进作用最为明显,而80 μg/ml的VAP表现出了削减其自身促进SCs迁移的作用,此作用与负反馈机制有关。4.p38-MAPK信号通路抑制剂SB203580和PI3K-AKT抑制剂LY294002都可明显抑制雪旺细胞的迁移,并可抑制VAP对SCs迁移的促进作用;VAP对SCs的迁移促进作用依赖于激活p38 MAPK和PI3K-AKT信号通路。5.VAP可以激活p38 MAPK和PI3K-AKT的磷酸化,并通过激活p38 MAPK和PI3K-AKT信号通路来促进并调控SCs的迁移以及在氧化应激状态下的存活和增殖,且这种作用程度与VAP浓度相关。运用p38 MAPK通路抑制剂SB203580和PI3K-AKT通路抑制剂LY294002能明显抑制通路的磷酸化激活程度,削弱了 VAP对SCs功能促进和细胞保护作用。VAP在一定程度上可抵抗通路抑制剂对p38 MAPK和PI3K-AKT信号通路的抑制作用。6.通过检测SCs表面的神经轴突导向因子（Netrin1）受体（UNC5A、UNC5B、UNC5C和UNC5D）的表达情况,进一步研究发现VAP可以通过与受体UNC5B结合后发挥对SCs迁移的促进作用。7.SCs转录组测序后对差异基因分析显示,VAP组与对照组相比产生2044个差异基因,其中上调的基因数目为970个,下调的基因数目为1074个。GO分析和KEGG通路富集分析表明,中间纤维细胞骨架的下调提示了 SCs在VAP干预后迁移及运动功能的改变;而神经激活性的配体-受体互作通路的上调表明,VAP对SCs功能的调节作用与神经激活性的配体-受体互作信号通路的上调相关。其中UNC5B是该通路中差异表达较大的基因;进一步佐证UNC5B是SCs表面与VAP结合的受体。8.动物实验发现,VAP可以在功能行为学改善大鼠坐骨神经损伤后的运动功能（SFI）和神经传导能力（NCV）,在组织形态学上促进大鼠坐骨神经轴突再生、髓鞘形成,在分子水平促进神经损伤部位GDNF和NGF的表达以及神经营养因子分泌。进一步的研究表明VAP特异性上调神经中受体UNC5B的表达,并激活p38 MAPK和PI3K-AKT信号通路,从而促进神经修复再生。研究结论本研究表明,VAP 可以通过上调UNC5B受体的表达,激活并调控p38 MAPK和PI3K-AKT信号通路,从而促进并调控SCs的迁移以及在氧化应激状态下的存活和增殖,这种作用依赖于SCs表面神经激活性的配体-受体互作方式。VAP将有望作为周围神经损伤的新型治疗药物,促进周围神经的修复和再生。此研究为治疗周围神经损伤提供新的药物靶点,并且为研究该药物促进神经再生的机制提供新的理论基础。