论文部分内容阅读
背景
在哺乳动物中枢神经系统中,神经干细胞(Neuralstemcells ，NSCs)是一类具有高度自我更新能力的神经前体细胞(Neuralprecursor cells，NPCs)，并能分化为具有功能的神经元和胶质细胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)。神经干细胞是重要的多能干细胞，NSCs使得再生医学拥有巨大的潜能，NSCs可以直接或间接替代已坏死的神经元，这种替代疗法是基于受损的神经元被新生细胞所替代或修复，从而为治疗众多神经系统疾病提供了新的方案。成年NSCs主要集中在脑室下区和海马结构齿状回区域，这些区域的NSCs保持着增殖分裂的能力。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR，为磷酸肌醇的3-激酶(PI3K)相关激酶的一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在哺乳动物中，mTOR主要以哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1 )与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)的形式存在，mTORC1主要是调控细胞生长、增殖和存活，在大脑中被酪氨酸激酶-RAS调节器控制,而mTORC2调控肌动蛋白细胞骨架。在干细胞功能调节中，mTOR也起着极为重要的作用。mTOR作为PI3K/Akt信号通路下游的一个效应分子，它的信号传导主要通过PI3K-AKT-mTOR途径激活，甚至激活下游靶蛋白P-S6R。有研究表明在中枢神经系统中mTOR参与了轴突再生，神经元活化以及树突分支。
特定细胞类型的基因表达涉及复杂的表观遗传学机制，包括DNA去甲基化和组蛋白修饰。DNA不同甲基化模式由DNA甲基转移酶来完成的。DNA甲基转移酶将DNA的胞嘧啶(5C)生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。研究表明Dnmts对维持DNA甲基化的过程具有重要作用，小鼠神经元去除Dnmt1表现基因组的低甲基化，促进神经干细胞向星形胶质细胞分化。在Tets(Tet1, Tet2, Tet3)蛋白家族的作用下，5mC可被催化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC),Tets蛋白生物功能的发现为5mC去甲基化机制提供了新的认识。
丙戊酸(valproic acid，VPA)作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂,主要用于抗癫痫和抗抑郁的一种常见临床药物。VPA通过抑制HDAC作用,促使组蛋白和DNA之间的亲和力下降,有利于细胞增长、增殖以及分裂。研究表明VPA具备神经保护作用，HDACs抑制可能通过上调特定神经元基因促进神经分化。目的
在发育和成年脑中，尽管mTOR信号和表观遗传学调节对神经干细胞分化起重要作用，然而在神经干细胞分化中mTOR信号与表观遗传修饰的直接联系仍不清楚。在我们的实验中，我们将证明其联系是否存在，如果存在，又将如何影响VPA诱导神经干细胞向神经元分化。
方法
第一部分：细胞培养24小时后，DotBlot及细胞免疫荧光法(IF)对整体甲基化定量。亚硫酸氢盐处理测序(BSP)和5mC分析对Ngn1基因启动子区5mC定量。
第二部分：WesternBlot及IF检测Tet1，Tet2，Tet3蛋白的表达，利用DotBlot法和IF对整体基因组5hmC定量，利用5hmC分析法定量Ngn1基因启动子区5hmC。
第三部分：WesternBlot验证Tets蛋白是否被敲低,然后利用DotBlot和IF观察5mC与5hmC的整体定量。WesternBlot检测特定神经元基因Ngn1的表达。IF检测Ngn1、DCX的荧光强度表达。BSP法和5hmC分析Tets敲低后Ngn1启动子区5mC和5hmC。
结果
第一部分：我们的IF结果显示，VPA组与对照组相比，5mC低表达在细胞核内，DotBlot结果显示与IF相一致。我们接下来检测VPA对特定基因启动子区甲基化的作用，BSP结果显示：在Ngn1启动子区-171至140间，VPA组与对照组相比降低40%，而VPA+Rapa组与VPA组相比增加20%。5mC分析进一步验证了上述结果。
第二部分：我们的WB结果显示，VPA组与对照组相比Tet1,2，3蛋白表达上调，而VPA+Rapa组与VPA组相比表达下调，对照组与Rapa组差异不显著，我们的IF结果与WB结果一致。为进一步确定Tets蛋白在调节DNA去甲基化中的作用，DotBlot分析表明VPA组与对照组相比5hmC上调，VPA+Rapa组与VPA组相比5hmC下降，5hmC的IF实验结果与DotBlot一致。为了探讨5hmC是否参与了神经分化的调节作用，我们应用5hmC分析检测5hmC在Ngn1启动子区的量，结果显示VPA组与对照组相比5hmC显著上调，而VPA+Rapa组与VPA组相比显著下降。
第三部分：为了检测VPA诱导分化中，Tets蛋白的激活是否是必须的，我们敲低了Tets表达，经shRNATets慢病毒转染的细胞与对照组相比Tet1，2，3表达明显降低，IF和DotBlot结果均表明shRNATet1,2，3组与VPA组相比，5hmC表达降低，5mC表达增加。同时我们也发现敲低Tets可明显降低Ngn1表达，且BSP法和5hmC分析结果证明Tets敲低可显著降低Ngn1启动子区5hmC的表达。
结论
1)VPA诱导神经元分化中mTOR信号增强被动DNA去甲基化
2)VPA诱导神经元分化中mTOR信号促进主动DNA去甲基化/羟甲基化
3)Tets蛋白参与VPA诱导神经干细胞向神经元分化。
在哺乳动物中枢神经系统中,神经干细胞(Neuralstemcells ，NSCs)是一类具有高度自我更新能力的神经前体细胞(Neuralprecursor cells，NPCs)，并能分化为具有功能的神经元和胶质细胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)。神经干细胞是重要的多能干细胞，NSCs使得再生医学拥有巨大的潜能，NSCs可以直接或间接替代已坏死的神经元，这种替代疗法是基于受损的神经元被新生细胞所替代或修复，从而为治疗众多神经系统疾病提供了新的方案。成年NSCs主要集中在脑室下区和海马结构齿状回区域，这些区域的NSCs保持着增殖分裂的能力。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR，为磷酸肌醇的3-激酶(PI3K)相关激酶的一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在哺乳动物中，mTOR主要以哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1 )与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)的形式存在，mTORC1主要是调控细胞生长、增殖和存活，在大脑中被酪氨酸激酶-RAS调节器控制,而mTORC2调控肌动蛋白细胞骨架。在干细胞功能调节中，mTOR也起着极为重要的作用。mTOR作为PI3K/Akt信号通路下游的一个效应分子，它的信号传导主要通过PI3K-AKT-mTOR途径激活，甚至激活下游靶蛋白P-S6R。有研究表明在中枢神经系统中mTOR参与了轴突再生，神经元活化以及树突分支。
特定细胞类型的基因表达涉及复杂的表观遗传学机制，包括DNA去甲基化和组蛋白修饰。DNA不同甲基化模式由DNA甲基转移酶来完成的。DNA甲基转移酶将DNA的胞嘧啶(5C)生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。研究表明Dnmts对维持DNA甲基化的过程具有重要作用，小鼠神经元去除Dnmt1表现基因组的低甲基化，促进神经干细胞向星形胶质细胞分化。在Tets(Tet1, Tet2, Tet3)蛋白家族的作用下，5mC可被催化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC),Tets蛋白生物功能的发现为5mC去甲基化机制提供了新的认识。
丙戊酸(valproic acid，VPA)作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂,主要用于抗癫痫和抗抑郁的一种常见临床药物。VPA通过抑制HDAC作用,促使组蛋白和DNA之间的亲和力下降,有利于细胞增长、增殖以及分裂。研究表明VPA具备神经保护作用，HDACs抑制可能通过上调特定神经元基因促进神经分化。目的
在发育和成年脑中，尽管mTOR信号和表观遗传学调节对神经干细胞分化起重要作用，然而在神经干细胞分化中mTOR信号与表观遗传修饰的直接联系仍不清楚。在我们的实验中，我们将证明其联系是否存在，如果存在，又将如何影响VPA诱导神经干细胞向神经元分化。
方法
第一部分：细胞培养24小时后，DotBlot及细胞免疫荧光法(IF)对整体甲基化定量。亚硫酸氢盐处理测序(BSP)和5mC分析对Ngn1基因启动子区5mC定量。
第二部分：WesternBlot及IF检测Tet1，Tet2，Tet3蛋白的表达，利用DotBlot法和IF对整体基因组5hmC定量，利用5hmC分析法定量Ngn1基因启动子区5hmC。
第三部分：WesternBlot验证Tets蛋白是否被敲低,然后利用DotBlot和IF观察5mC与5hmC的整体定量。WesternBlot检测特定神经元基因Ngn1的表达。IF检测Ngn1、DCX的荧光强度表达。BSP法和5hmC分析Tets敲低后Ngn1启动子区5mC和5hmC。
结果
第一部分：我们的IF结果显示，VPA组与对照组相比，5mC低表达在细胞核内，DotBlot结果显示与IF相一致。我们接下来检测VPA对特定基因启动子区甲基化的作用，BSP结果显示：在Ngn1启动子区-171至140间，VPA组与对照组相比降低40%，而VPA+Rapa组与VPA组相比增加20%。5mC分析进一步验证了上述结果。
第二部分：我们的WB结果显示，VPA组与对照组相比Tet1,2，3蛋白表达上调，而VPA+Rapa组与VPA组相比表达下调，对照组与Rapa组差异不显著，我们的IF结果与WB结果一致。为进一步确定Tets蛋白在调节DNA去甲基化中的作用，DotBlot分析表明VPA组与对照组相比5hmC上调，VPA+Rapa组与VPA组相比5hmC下降，5hmC的IF实验结果与DotBlot一致。为了探讨5hmC是否参与了神经分化的调节作用，我们应用5hmC分析检测5hmC在Ngn1启动子区的量，结果显示VPA组与对照组相比5hmC显著上调，而VPA+Rapa组与VPA组相比显著下降。
第三部分：为了检测VPA诱导分化中，Tets蛋白的激活是否是必须的，我们敲低了Tets表达，经shRNATets慢病毒转染的细胞与对照组相比Tet1，2，3表达明显降低，IF和DotBlot结果均表明shRNATet1,2，3组与VPA组相比，5hmC表达降低，5mC表达增加。同时我们也发现敲低Tets可明显降低Ngn1表达，且BSP法和5hmC分析结果证明Tets敲低可显著降低Ngn1启动子区5hmC的表达。
结论
1)VPA诱导神经元分化中mTOR信号增强被动DNA去甲基化
2)VPA诱导神经元分化中mTOR信号促进主动DNA去甲基化/羟甲基化
3)Tets蛋白参与VPA诱导神经干细胞向神经元分化。