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研究背景
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种最为常见的神经退行性疾病，其发病率仅次于阿尔茨海默病。细胞移植疗法被认为是非常有潜力的治疗帕金森病的方法，多能干细胞(Pluripotent stem cells，PSCs)，如胚胎干细胞ESCs和诱导性多能干细胞iPSCs，可以为细胞移植疗法提供细胞来源。获得足够数量的多巴胺能(Dopaminergic，DA)神经元是细胞移植治疗帕金森病的前提条件。然而，使用目前的培养方法对PSCs进行诱导，分化产物中可能会含有一些非神经类的增殖细胞，以及未分化的细胞，这些细胞移植到体内有形成肿瘤的风险。虽然目前已经发现一些细胞因子与神经发生有关，但PSCs向DA能神经元分化的具体分子机制仍需进一步研究。
转化生长因子-β(TGF-β)信号通路在细胞生长、迁移、增殖、分化、存活、凋亡等一系列细胞生理进程中发挥重要作用。有越来越多的证据表明TGF-β信号通路与DA能神经元的分化有关。许多研究表明，PSCs分化为神经类细胞的过程中需要抑制TGF-β/Activin/Nodal信号通路。并且，目前很多实验室使用BMP和TGF-β信号通路的小分子抑制剂来诱导PSCs分化为DA能神经元。然而，DA能神经元分化过程中TGF-β信号通路的小分子抑制剂所起的作用仍然不十分清楚。
微小RNAs(miRNAs)是一类非编码RNA，大小约为21-23个核苷酸长度。MiRNAs作为调控因子能在转录后水平调控基因的表达，它在很多生理和病理进程(如细胞生长、自我更新、细胞增殖、分化以及凋亡)中发挥关键作用。有证据显示miRNAs可以通过作用于TGF-β超家族的受体、Smads蛋白以及信号通路的其他成员来调控TGF-β信号的传导。尽管有研究报道称miRNAs可以调控DA能神经祖细胞的发育，但是目前仍不清楚miRNAs与TGF-β之间是否存在协作关系来影响PSCs向DA能神经元分化。
本研究首先探索了一套新的DA能神经元诱导方法。然后又分别用小分子抑制剂和miRNA来调控TGF-β信号通路，进而观察PSCs的DA能神经元分化效率，以期达到多方法、多角度论证TGF-β信号通路作用机制的目的。
第一部分体外诱导小鼠ESCs/iPSCs向DA能神经元分化
目的探索一套新的诱导分化体系，提高多能干细胞诱导分化为DA能神经元的效率。
方法实验组ESCs/iPSCs消化为单细胞并按0.5–1.5×104/cm2的密度接种到明胶包被的培养皿中，以ESCs/iPSCs培养基培养。24h后，更换为N2B27培养基。在分化的第5天，向N2B27培养基中添加SHH-C24II(100ng/ml)，Purmorphamine(2μmol/L)，Laminin(1μg/ml)，bFGF(20ng/ml)和FGF8a(100ng/ml)，此为扩增培养基。培养6d后撤去上述细胞因子，培养基换为含1μg/mlLaminin，20ng/mlBDNF，20ng/mlGDNF，200μmol/LAA以及1μmol/LcAMP的分化培养基。每隔一天换液一次，培养10d。对照组ESCs/iPSCs细胞消化为单细胞接种，以N2B27培养基培养10d，然后换为分化培养基再培养10d。以qRT-PCR和免疫荧光染色检测分化细胞中的多巴胺能神经元特异性标志物。
结果与对照组相比，实验组DA能神经元特异性标志物，如TH、Map2、Nurr1、Lmx1a和Foxa2的表达量显著升高(P＜0.05)。TH/Map2阳性神经元计数：ESCs对照组2.5±0.8%，ESCs实验组36.1±4.6%；iPSCs对照组2.7±1.4%，iPSCs实验组33.3±3.2%。TH/Foxa2阳性神经元计数：ESCs对照组1.3±0.3%，ESCs实验组17.9±2.1%；iPSCs对照组1.6±0.5%，iPSCs实验组20.2±1.9%。实验组TH/Map2和TH/Foxa2阳性细胞数明显高于对照组(P＜0.05)。
结论联合使用SHH-C24II，Purmorphamine，bFGF和FGF8a等细胞因子，能较高效率地诱导ESCs/iPSCs分化为DA能神经元。
第二部分TGF-β信号通路抑制剂对ESCs/iPSCs向DA能神经元分化的影响
目的探讨TGF-β信号通路抑制剂在多能干细胞向DA能神经元分化的作用。
方法将ESCs/iPSCs消化成单细胞后接种到明胶包被的培养皿中，以ESCs/iPSCs培养基培养，第二天换为N2B27培养基。在分化前4d，使用SB431542或LDN193189或两者联合使用(抑制剂联合使用组)处理细胞。为更好的探讨SB431542和LDN193189的作用，并排除其他细胞因子的影响，SB431542组和LDN193189组不使用含SHH-C24II、Purmorphamine、bFGF、FGF8a等因子的扩增培养基。为研究SB431542和LDN193189的联合应用是否能与其他细胞因子一起协同诱导DA能神经元的分化，在抑制剂联合使用组(SB431542+LDN193189组)使用扩增培养基。在分化的不同时间段，对细胞进行相关标志物的免疫荧光染色及qRT-PCR检测。
结果免疫荧光染色结果表明LDN193189组和抑制剂联合使用组TH/Map2阳性细胞数明显高于相应的对照组。QRT-PCR结果发现LDN193189组和抑制剂联合使用组的DA能神经元标志物，如TH、Map2、Foxa2、En1的表达量明显升高。SB431542组和LDN193189组神经干细胞标志物(Sox1、Nestin、Pax6)和神经元标志物(Map2)表达量均有明显提高。但SB431542组的DA能神经元标志物表达量没有增高，并且DA能神经元数量也没有明显升高。
结论联合使用TGF-β抑制剂SB431542和LDN19189能提高多能干细胞分化为DA能神经元的比率。LDN193189促进多能干细胞向神经干细胞分化，并诱导DA能神经元形成。SB431542可促进多能干细胞的神经分化，但并没有明显的DA能神经元诱导作用。
第三部分MiR-146b-5p通过调控TGF-β信号通路影响ESCs/iPSCs神经分化
目的探讨miR-146b-5p在ESCs/iPSCs神经分化过程中的作用。
方法构建过表达miR-146b-5p和Smad4的ESCs/iPSCs细胞系，用单层贴壁培养方法对这些细胞进行诱导分化。培养9d后，qRT-PCR检测各组细胞中神经外胚层特异性标志物Sox1、Nestin、Pax6的表达量。流式细胞仪检测Nestin阳性细胞数量。在ESCs/iPSCs分化早期转染miR-146b-5pmimic，并使用单层贴壁培养方法进行诱导分化。
结果ESCs/iPSCs向神经谱系分化后，miR-146b-5p表达量明显升高。ESCs/iPSCs-miR-146b-5p来源的细胞中Sox1、Nestin、Pax6的表达量显著增高。流式细胞计数结果也表明ESCs/iPSCs-miR-146b-5p组的Nestin阳性细胞数比对照组高。此外，ESCs/iPSCs-Smad4细胞系的神经分化被明显抑制。双荧光素酶报告基因实验表明转染了野生型Smad43′UTR和miR-146b-5p质粒的293T细胞中荧光素酶活性有显著下降。ESCs/iPSCs-mimic组细胞分化至20d，TH、Map2的表达量明显高于对照组，且TH/Map2阳性细胞数也高于对照组。
结论Smad4是miR-146b-5p的直接靶基因。MiR-146b-5p通过下调Smad4来负调控TGF-β信号通路，从而促进小鼠多能性干细胞的神经分化。另外，ESCs/iPSCs-miR-146b-5p细胞系中Oct4表达量明显下降，这也可能是这些细胞更倾向于分化为神经干细胞的原因之一。在分化的早期阶段过表达miR-146b-5p能促进ESCs/iPSCs分化为DA能神经元。
总结：
1.联合使用SHH-C24II，Purmorphamine，bFGF和FGF8a等细胞因子，能较高效率地诱导ESCs/iPSCs分化为DA能神经元。
2.联合使用TGF-β抑制剂SB431542和LDN193189能提高多能干细胞分化为DA能神经元的比率。LDN193189促进多能干细胞向神经干细胞分化，并诱导DA能神经元形成。SB431542可促进多能干细胞的神经分化，但并没有明显的DA能神经元诱导作用。
3.Smad4是miR-146b-5p的直接靶基因。MiR-146b-5p通过下调Smad4来负调控TGF-β信号通路，从而促进小鼠多能性干细胞的神经分化。另外，ESCs/iPSCs-miR-146b-5p细胞系中Oct4表达量明显下降，这也可能是这些细胞更倾向于分化为神经干细胞的原因之一。在分化的早期阶段过表达miR-146b-5p能促进ESCs/iPSCs分化为DA能神经元。
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种最为常见的神经退行性疾病，其发病率仅次于阿尔茨海默病。细胞移植疗法被认为是非常有潜力的治疗帕金森病的方法，多能干细胞(Pluripotent stem cells，PSCs)，如胚胎干细胞ESCs和诱导性多能干细胞iPSCs，可以为细胞移植疗法提供细胞来源。获得足够数量的多巴胺能(Dopaminergic，DA)神经元是细胞移植治疗帕金森病的前提条件。然而，使用目前的培养方法对PSCs进行诱导，分化产物中可能会含有一些非神经类的增殖细胞，以及未分化的细胞，这些细胞移植到体内有形成肿瘤的风险。虽然目前已经发现一些细胞因子与神经发生有关，但PSCs向DA能神经元分化的具体分子机制仍需进一步研究。
转化生长因子-β(TGF-β)信号通路在细胞生长、迁移、增殖、分化、存活、凋亡等一系列细胞生理进程中发挥重要作用。有越来越多的证据表明TGF-β信号通路与DA能神经元的分化有关。许多研究表明，PSCs分化为神经类细胞的过程中需要抑制TGF-β/Activin/Nodal信号通路。并且，目前很多实验室使用BMP和TGF-β信号通路的小分子抑制剂来诱导PSCs分化为DA能神经元。然而，DA能神经元分化过程中TGF-β信号通路的小分子抑制剂所起的作用仍然不十分清楚。
微小RNAs(miRNAs)是一类非编码RNA，大小约为21-23个核苷酸长度。MiRNAs作为调控因子能在转录后水平调控基因的表达，它在很多生理和病理进程(如细胞生长、自我更新、细胞增殖、分化以及凋亡)中发挥关键作用。有证据显示miRNAs可以通过作用于TGF-β超家族的受体、Smads蛋白以及信号通路的其他成员来调控TGF-β信号的传导。尽管有研究报道称miRNAs可以调控DA能神经祖细胞的发育，但是目前仍不清楚miRNAs与TGF-β之间是否存在协作关系来影响PSCs向DA能神经元分化。
本研究首先探索了一套新的DA能神经元诱导方法。然后又分别用小分子抑制剂和miRNA来调控TGF-β信号通路，进而观察PSCs的DA能神经元分化效率，以期达到多方法、多角度论证TGF-β信号通路作用机制的目的。
第一部分体外诱导小鼠ESCs/iPSCs向DA能神经元分化
目的探索一套新的诱导分化体系，提高多能干细胞诱导分化为DA能神经元的效率。
方法实验组ESCs/iPSCs消化为单细胞并按0.5–1.5×104/cm2的密度接种到明胶包被的培养皿中，以ESCs/iPSCs培养基培养。24h后，更换为N2B27培养基。在分化的第5天，向N2B27培养基中添加SHH-C24II(100ng/ml)，Purmorphamine(2μmol/L)，Laminin(1μg/ml)，bFGF(20ng/ml)和FGF8a(100ng/ml)，此为扩增培养基。培养6d后撤去上述细胞因子，培养基换为含1μg/mlLaminin，20ng/mlBDNF，20ng/mlGDNF，200μmol/LAA以及1μmol/LcAMP的分化培养基。每隔一天换液一次，培养10d。对照组ESCs/iPSCs细胞消化为单细胞接种，以N2B27培养基培养10d，然后换为分化培养基再培养10d。以qRT-PCR和免疫荧光染色检测分化细胞中的多巴胺能神经元特异性标志物。
结果与对照组相比，实验组DA能神经元特异性标志物，如TH、Map2、Nurr1、Lmx1a和Foxa2的表达量显著升高(P＜0.05)。TH/Map2阳性神经元计数：ESCs对照组2.5±0.8%，ESCs实验组36.1±4.6%；iPSCs对照组2.7±1.4%，iPSCs实验组33.3±3.2%。TH/Foxa2阳性神经元计数：ESCs对照组1.3±0.3%，ESCs实验组17.9±2.1%；iPSCs对照组1.6±0.5%，iPSCs实验组20.2±1.9%。实验组TH/Map2和TH/Foxa2阳性细胞数明显高于对照组(P＜0.05)。
结论联合使用SHH-C24II，Purmorphamine，bFGF和FGF8a等细胞因子，能较高效率地诱导ESCs/iPSCs分化为DA能神经元。
第二部分TGF-β信号通路抑制剂对ESCs/iPSCs向DA能神经元分化的影响
目的探讨TGF-β信号通路抑制剂在多能干细胞向DA能神经元分化的作用。
方法将ESCs/iPSCs消化成单细胞后接种到明胶包被的培养皿中，以ESCs/iPSCs培养基培养，第二天换为N2B27培养基。在分化前4d，使用SB431542或LDN193189或两者联合使用(抑制剂联合使用组)处理细胞。为更好的探讨SB431542和LDN193189的作用，并排除其他细胞因子的影响，SB431542组和LDN193189组不使用含SHH-C24II、Purmorphamine、bFGF、FGF8a等因子的扩增培养基。为研究SB431542和LDN193189的联合应用是否能与其他细胞因子一起协同诱导DA能神经元的分化，在抑制剂联合使用组(SB431542+LDN193189组)使用扩增培养基。在分化的不同时间段，对细胞进行相关标志物的免疫荧光染色及qRT-PCR检测。
结果免疫荧光染色结果表明LDN193189组和抑制剂联合使用组TH/Map2阳性细胞数明显高于相应的对照组。QRT-PCR结果发现LDN193189组和抑制剂联合使用组的DA能神经元标志物，如TH、Map2、Foxa2、En1的表达量明显升高。SB431542组和LDN193189组神经干细胞标志物(Sox1、Nestin、Pax6)和神经元标志物(Map2)表达量均有明显提高。但SB431542组的DA能神经元标志物表达量没有增高，并且DA能神经元数量也没有明显升高。
结论联合使用TGF-β抑制剂SB431542和LDN19189能提高多能干细胞分化为DA能神经元的比率。LDN193189促进多能干细胞向神经干细胞分化，并诱导DA能神经元形成。SB431542可促进多能干细胞的神经分化，但并没有明显的DA能神经元诱导作用。
第三部分MiR-146b-5p通过调控TGF-β信号通路影响ESCs/iPSCs神经分化
目的探讨miR-146b-5p在ESCs/iPSCs神经分化过程中的作用。
方法构建过表达miR-146b-5p和Smad4的ESCs/iPSCs细胞系，用单层贴壁培养方法对这些细胞进行诱导分化。培养9d后，qRT-PCR检测各组细胞中神经外胚层特异性标志物Sox1、Nestin、Pax6的表达量。流式细胞仪检测Nestin阳性细胞数量。在ESCs/iPSCs分化早期转染miR-146b-5pmimic，并使用单层贴壁培养方法进行诱导分化。
结果ESCs/iPSCs向神经谱系分化后，miR-146b-5p表达量明显升高。ESCs/iPSCs-miR-146b-5p来源的细胞中Sox1、Nestin、Pax6的表达量显著增高。流式细胞计数结果也表明ESCs/iPSCs-miR-146b-5p组的Nestin阳性细胞数比对照组高。此外，ESCs/iPSCs-Smad4细胞系的神经分化被明显抑制。双荧光素酶报告基因实验表明转染了野生型Smad43′UTR和miR-146b-5p质粒的293T细胞中荧光素酶活性有显著下降。ESCs/iPSCs-mimic组细胞分化至20d，TH、Map2的表达量明显高于对照组，且TH/Map2阳性细胞数也高于对照组。
结论Smad4是miR-146b-5p的直接靶基因。MiR-146b-5p通过下调Smad4来负调控TGF-β信号通路，从而促进小鼠多能性干细胞的神经分化。另外，ESCs/iPSCs-miR-146b-5p细胞系中Oct4表达量明显下降，这也可能是这些细胞更倾向于分化为神经干细胞的原因之一。在分化的早期阶段过表达miR-146b-5p能促进ESCs/iPSCs分化为DA能神经元。
总结：
1.联合使用SHH-C24II，Purmorphamine，bFGF和FGF8a等细胞因子，能较高效率地诱导ESCs/iPSCs分化为DA能神经元。
2.联合使用TGF-β抑制剂SB431542和LDN193189能提高多能干细胞分化为DA能神经元的比率。LDN193189促进多能干细胞向神经干细胞分化，并诱导DA能神经元形成。SB431542可促进多能干细胞的神经分化，但并没有明显的DA能神经元诱导作用。
3.Smad4是miR-146b-5p的直接靶基因。MiR-146b-5p通过下调Smad4来负调控TGF-β信号通路，从而促进小鼠多能性干细胞的神经分化。另外，ESCs/iPSCs-miR-146b-5p细胞系中Oct4表达量明显下降，这也可能是这些细胞更倾向于分化为神经干细胞的原因之一。在分化的早期阶段过表达miR-146b-5p能促进ESCs/iPSCs分化为DA能神经元。