[研究背景及目的]目前在骨缺损及骨损伤的临床治疗中,随着研究的不断深入,组织工程骨被认为是治疗大节段骨缺损最有发展前景的方法之一。而具有良好的组织细胞相容性、可吸收性、可塑性、与天然骨组织相似的三维孔隙结构的支架材料是研究的重点,但迄今仍未有一种理想的支架材料应用于临床。研究表明组织工程骨种子细胞粘附生长困难、成骨效率低、血管化不良、排异以及机体干细胞归巢动员能力差是导致组织工程骨体内骨缺损修复不良的重要因素。课题组前期制备的猪椎骨脱蛋白骨为天然骨衍生物,排除了免疫因素,又具有天然的孔隙,但由于脱去蛋白,因此物理强度明显下降,同时种子细胞粘附增殖受到影响,也影响了微血管长入以及体内干细胞的归巢。因此,本研究采用胶原蛋白在部分脱蛋白骨(PDPB)材料表面构建纳米超薄膜,为骨缺损进入临床治疗构建良好机械力学强度、无免疫原性、高亲水性、有利于细胞生长及功能表达,帮助新生血管形成、有利于干细胞归巢、粘附生长的高效修复支架材料提供系统化技术支持。[方法](1)颈椎脱臼处死SD大鼠,取双侧股骨采用全骨髓贴壁法分离、纯化和培养骨髓间充质干细胞,细胞培养至第3代时进行成骨、成脂、成软骨分化鉴定骨髓间充质干细胞。(2)按动物实验分组制备植入的支架材料及骨髓间充质干细胞(BMSCs)的复苏。将之前制备的单纯PDPB磨制成4x2x2mm大小骨块。经75%乙醇浸泡后冷冻干燥机干燥。并分成两组,分别为未做处理的单纯PDPB和经多聚赖氨酸形成复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB。并按如下分组植入。A组单纯骨缺损组,无支架材料;B组为单纯PDPB组;C组为复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB;D组为复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB+尾静脉注射BMSCs。(3)SD大鼠48只随机分成A、B、C、D4组,每组12只。A组单纯骨缺损组,无支架材料;B组为单纯PDPB组;C组为复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB;D组为复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB+尾静脉注射BMSCs)。于大鼠股骨中段用小型电钻磨出4×2×2mm大小不离断骨缺损,并按如上分组给予植入相应的植入物并尾静脉注射BMSCs。于术后2周、4周、6周、8周通过DR摄片、大体标本观察及组织切片HE染色连续动态观察不同组植入的支架材料在骨缺损修复过程中的作用。[结果](1)SD大鼠采用全骨髓贴壁法分离、纯化和培养骨髓间充质干细胞,可得到高纯度的BMSCs,第三代BMSCs经诱导分化可分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。(2)支架植入术后一般情况观察:术后平均约2分钟内苏醒,苏醒后在饲养笼内可自由活动,饮食、饮水正常。手术切口无红肿、渗血、渗液,愈合良好。术后第4天首次拍摄X线片观察发现其中有4只大鼠股骨骨折,其余骨缺损形成良好。造模成功率为92%。(3)术后X线观察:A组术后2周X线下骨缺损仍然可见,4周至6-8周缺损处逐渐愈合。B、C、D组术后2周X线可见移植物外型轮廓清晰,4-8周可见移植物外型轮廓逐渐淡化,影像变得模糊,骨块与缺损处界限消失,与原有股骨缺损部位融合。各组的横向对比可见D组较C组、B组随移植、修复时间的延长,移植骨块自身被吸收与缺损处融合更为明显,且愈合较好。(4)大体标本观察结果:A组术后2周缺损处有大量纤维骨痂生成,4周出现骨性修复,6-8周基本骨性愈合。B、C、D组术后2周可见移植骨块被纤维及软组织包裹,并骨块,移植骨块与骨缺损处固定牢固,骨块表面孔隙可见,第4-8周B、C、D各组骨缺损处纤维组织包裹更加致密,第8周可见植入骨块已部分被吸收、体积变小并与缺损处逐渐融合,C、D组的愈合过程优于B组。(5)组织学切片HE染色结果显示第2周、4周、6周、8周A组(单纯骨缺损组)可自行愈合;B、C、D组植入材料的孔隙内有大量骨髓细胞长入,并且D组较C、B组早期有大量血管长入。2周时清晰可见的植入材料在随着新骨的生成逐渐降解,植入物骨端与骨缺损骨端逐渐融合。第8周时D组愈合效果最佳。[结论](1)全骨髓贴壁法是一种理想的骨髓间充质干细胞分离、体外扩增的方法。通过此方法可以在短时间内可到大量的骨髓间充质干细胞,并且细胞活性好、稳定,具有高度的分化潜能。为骨髓间充质干细胞在组织工程应用及临床损伤修复的治疗的进一步研究提供了基础。(2)通过本实验建立了 SD大鼠的股骨不离断的骨缺损动物模型。验证了不离断的大鼠股骨中段4×2×2mm缺损可自行愈合。(3)复合胶原蛋白的纳米超薄膜PDPB较单纯的PDPB的组织相容性更好,,在支架材料降解的同时能够快速形成新骨,其降解、吸收速度适宜。复合胶原蛋白的纳米超薄膜PDPB复合BMSC构建的组织工程骨有效促进骨缺损修复。(4)经尾静脉注射BMSCs早期有大量的血管长入,提示胶原蛋白纳米超薄膜可诱导骨髓间充质干细胞归巢对骨组织损伤进行修复。