研究背景及目的:分泌型磷脂酶A₂（secretory phospholipaseA₂ sPLA₂）（E.C.3.1.1.4）是一类催化甘油磷脂二位脂肪酸水解的酶,是生产花生四烯酸（AA）、前列腺素（PGs）、白三烯（LT）及血小板活化因子（PAF）等炎性因子的限速酶,在炎症反应中起关键性作用。PLIγ（PLA₂ inhibitor）是蛇肝脏表达的一种蛋白,可特异性结合蛇毒PLA₂,发挥解毒作用。实验室前期发现哺乳动物PLA₂与蛇毒PLA₂结构高度相似,认为抗蛇毒蛋白PLIγ也具有抑制人PLA₂作用。为了验证PLIγ与sPLA₂存在相互作用,检测PLIγ的抗炎症效果。本研究制备了抗PLIγ单克隆抗体,利用PLIγ重组表达和免疫共沉淀技术,检测了PLIγ与人sPLA₂相互作用,并鉴定了与PLIγ互作的sPLA₂亚型。本论文构建了小鼠足趾肿胀炎症模型,腹腔注射给药PLIγ,通过组织切片和HE染色观察足趾组织病理变化,利用Western Blot检测足趾sPLA₂表达水平,利用ELISA法检测组织TNF-α和IL-1β表达水平,以此评价PLIγ抗炎症作用。本研究为PLIγ抗毒抗炎药物开发奠定了基础。本研究分为3部分,主要研究方法及结果如下:第1部分:PLIγ单克隆抗体的制备及鉴定方法:1、用DNAstar软件分析华游蛇PLIγ二级结构、亲疏水性和抗原表位,避开PLIγ活性中心,最后得到候选抗原肽151CPVLRLSNRTHEANRNDLIKVA172。命名为SHE,固相合成多肽并采用HPLC进行纯化。2、将SHE分别与KLH、BSA进行偶联制备免疫原及包被抗原。3、取60μg SHE-KLH偶联蛋白与完全弗氏佐剂等体积乳化后,皮下多点注射6周龄BALB/c雌性小鼠,在第14天,28天和42天,采取不完全弗氏佐剂乳化的SHE-KLH 30μg进行皮下注射免疫,总共进行4次免疫。最后一次免疫7天后,以SHE-BSA融合蛋白包被96孔板,用iELISA法检测小鼠血清效价。4、血清效价达到要求后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞,用聚乙二醇法（PEG）进行融合,用含HAT的IMDM完全培养基筛选杂交瘤细胞。同样以SHE-BSA包被,对杂交瘤细胞进行ELISA筛选。使用小鼠免疫球蛋白试剂盒进行杂交瘤细胞株亚型鉴定。5、阳性杂交瘤抗体鉴定。用原核表达His6-PLIγ及华游蛇PLIγ进行Western Blot检测,阳性细胞上清液作为一抗检测,His6标签抗体作为阳性对照。6、杂交瘤细胞经扩大培养后打入小鼠腹腔,收集腹水,使用Protein G Sepharose亲和层析纯化PLIγ抗体。7、Western Blot检测12种蛇血清中PLIγ蛋白,纯化PLIγ抗体作为一抗。结果:1、使用DNAStar Protean程序预测华游蛇PLIγ二级结构,柔性区域,亲水性,表面可及性和抗原指数。其中8-27,68-84,108-122,131-136,151-172和176-182肽段具有良好的亲水性和抗原指数,综合二级结构、表面可及性确定最佳候选肽:151CPVLRLSNRTHEANRNDLIKVA172。合成SHE肽经HPLC测定纯度为95%。2、经过2轮ELISA筛选最终获得21株阳性细胞株。抗体亚类鉴定后获得18株IgG亚型阳性细胞株。经Western Blot检测,18株细胞表达的抗体均与天然及重组PLIγ均有特异性反应,且与His6标签抗体条带位置一致。3.Western Blot检测,除金环蛇血清外,其余11种血清蛋白均与PLIγ抗体有特异性反应。有趣的是,有毒蛇PLIγ分子量通常高于无毒蛇。第2部分:PLIγ与人sPLA₂亚型相互作用研究方法:1、用LipoFiter^TM将质粒pIRES₂-EGFP-PLIγ转染293T细胞,转染后第24、48h用荧光显微镜观察转染效率。2、48h后提取293T细胞总蛋白,利用免疫共沉淀检测PLIγ与细胞sPLA₂各亚型的相互作用。结果:1、转染后第24、48h,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白,转染率高达90%。2、免疫共沉淀检测发现PLIγ与细胞sPLA₂ IB、II A、V、X等亚型存在着相互作用。第3部分:PLIγ对小鼠足趾肿胀的抗炎作用及机理研究方法:1、Balb/c小鼠随机分为六组（n=5）:阴性对照组（NS）、模型组（Model）、阳性对照组（2.5mg/kg地塞米松DXM）、PLIγ低剂量组（1mg/kg）、PLIγ中剂量组（2.5mg/kg）、PLIγ高剂量组（5mg/kg）。阴性对照组（NS）双后肢足趾注射30μL生理盐水,另外5组小鼠左后肢注射30μL生理盐水,右后肢注射30μL1%角叉菜胶,构建足趾肿胀模型。注射30min后,阴性对照组及模型组腹腔注射150μL生理盐水。实验组分别腹腔注射等体积地塞米松（2.5mg/kg）与三种剂量华游蛇PLIγ。注射角叉菜胶前,使用游标卡尺测量小鼠右后肢足趾的厚度记作0h,作为正常对照组。注射角叉菜胶后,每隔1h测量足趾厚度,连续测量4h记录数据,计算小鼠足趾肿胀度及肿胀抑制率。在第4h时,对小鼠的左右后肢足趾进行拍照,然后将小鼠颈椎脱臼处死,减取右后肢足趾,放置于冰上,取出足趾肌肉组织,经切片后,HE染色观察足趾组织病理学特征。2、Western Blot检测各组足趾组织IB、II A、V、X型sPLA₂含量。3、将PLIγ蛋白与模型组足趾总蛋白4°C孵育过夜,通过coIP检测PLIγ与小鼠足趾sPLA₂蛋白的相互作用。4、ELISA检测各组小鼠足趾裂解液TNF-α和IL-1β的水平。结果:1、足趾肿胀照片表明,地塞米松和PLIγ均可缓解角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀反应,PLIγ抑制效果与剂量成正比,高剂量组与生理盐水组无明显差别。2、病理学切片显示,模型组足趾有大量中性粒细胞浸润及严重的组织损伤,地塞米松和PLIγ组中性粒细胞数量和组织细胞损伤显著降低。PLIγ保护作用呈剂量效应。3、Western Blot结果表明,PLIγ可抑制足趾组织中IB、II A、V、X型sPLA₂的表达,并具有剂量效应,其中对sPLA₂ II A的抑制作用尤为显著。4、体外免疫共沉淀表明PLIγ通过结合sPLA₂ IB、II A发挥抑制活性。5、ELISA检测结果,PLIγ对小鼠足趾裂解液TNF-α和IL-1β水平有显著的抑制作用。结论:1、成功制备PLIγ单克隆抗体,获得了18株IgG亚型阳性细胞株。2、PLIγ与多种sPLA₂亚型存在直接的相互作用。3、PLIγ呈剂量依赖性抑制角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀,可显著降低足趾TNF-α和IL-1β的表达,主要抑制sPLA₂ II A蛋白发挥抗炎作用。