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目的:类风湿性关节炎(RA)是一种T细胞介导的,以滑膜炎为主要特征,同时伴有关节软骨及骨损伤的自身免疫性疾病。目前尚缺乏有效的治疗药物。由于RA的患病率高、致残率高、病因尚未完全阐明,特别是RA给社会经济、劳动力造成了严重损失,因此,对RA治疗的研究具有重要的医学和社会经济意义。骨保护素(OPG)属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员,研究表明OPG具有负向调节破骨细胞(OC)的分化和活化并促进OC凋亡,从而抑制骨吸收的功能;动物试验发现,T细胞在RA炎症的发生发展中起着重要作用,近年来的研究提示,热休克蛋白(HSP)肽段可通过调节T细胞功能抑制RA的炎性反应。因此,为了解决RA中骨破坏及炎症损伤两大难题,以人骨保护素的功能性基因片段与结核杆菌热休克蛋白70基因片段联合,构建嵌合载体,在昆虫细胞中表达,并对融合蛋白进行生物学活性鉴定,为进一步研究此融合蛋白对RA及其他炎性骨疾病的治疗作用奠定基础。
实验方法及结果:
方法:将人OPG功能片段p22—194和结核杆菌HSP70功能片段p111—125基因克隆至杆状病毒转座载体pENTRTM/SD/D-TOPO中,将重组转座载体与BaculoDirectTM Linear DNA进行LR重组连接反应,构建出重组杆状病毒DNA,获得重组病毒rAcV—Bac—OPG—HSP70。PCR鉴定重组病毒,转染昆虫细胞Sf9,在Sf9细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blotting分析后大量表达融合蛋白,用Ni柱纯化。经破骨细胞生成抑制试验和抑炎试验检测表达产物的生物活性。
结果:rAcV—Bac—OPG—HSP70直接转染昆虫细胞得到rAcV—Bac—OPG—HSP70。重组病毒在感染后48h开始出现一相对分子质量为28000大小的特异带,感染后72h蛋白量达到最大,96h蛋白量开始减少。在正常昆虫Sf9细胞的对照中未见该蛋白带。Western bloting显示带有His标签的目的蛋白条带与His抗体发生特异反应。破骨细胞生长抑制实验检测表明该融合蛋白能够减少破骨细胞的生成数量,提示其可能具有抑制骨破坏的生物活性;抑炎实验表明融合蛋白具有显著减轻迟发型超敏反应(DTH)小鼠模型炎症反应程度的作用,说明融合蛋白中HSP70具有抑制炎症的生物学活性。
结论:利用杆状病毒表达系统可成功表达具有抑制破骨细胞生长和抑炎生物学活性的OPG—HSP70融合蛋白。