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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）主要引起母猪繁殖障碍，公猪精液质量下降，以及仔猪呼吸系统疾病，给全球养猪业造成了巨大的经济损失，其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）。PRRSV属于动脉炎病毒科，为单股正链、有囊膜的RNA病毒，基因组长度约为15kb。 在与病毒长期共存的过程中，宿主进化出一些抗病毒基因，这些抗病毒基因编码的蛋白，即宿主限制因子，可以抑制病毒的增殖。锌指抗病毒蛋白(Zinc finger antiviral protein，ZAP)是一种重要的宿主限制因子，存在两种剪接变异体(ZAP-L和ZAP-S)。以前的研究证实ZAP的两种剪接变异体对多种病毒具有抑制作用。目前，对猪源ZAP的研究较少，其能否抑制PRRSV的增殖也未见报道。鉴于此，本论文以PRRSV、猪源ZAP和PRRSV nsp4作为研究对象，探究ZAP是否能够抑制PRRSV的增殖及其抗病毒机制，同时探究PRRSV是否存在拮抗ZAP抗病毒作用的机制。主要研究内容如下: 1.超表达ZAP抑制PRRSV的增殖 克隆了猪源ZAP两种剪切变异体（ZAP-L和ZAP-S）的全长cDNA，并构建了真核表达质粒Flag-ZAP-L和Flag-ZAP-S。将其分别转染MARC-145细胞，转染24h后接种0.5MOI的PRRSV，在PRRSV感染24h后收样，通过Real-time PCR、TCID50、IFA以及Western blot检测超表达ZAP对PRRSV增殖的影响，结果表明超表达ZAP-L和ZAP-S均显著抑制PRRSV的增殖，并呈剂量依赖性。 2.ZAP不靶向PRRSV的5UTR和3UTR 以前的研究报道ZAP可以通过靶向病毒的5UTR和3UTR从RNA水平上抑制辛德毕斯病毒等病毒的增殖。为了探究ZAP是否靶向PRRSV的5UTR和3UTR，分别将PRRSV的5UTR和3UTR克隆到pGL3control载体上，然后将Flag-ZAP-L和Flag-ZAP-S以及空载体pCAGGS-Flag分别与pGL3control-PRRSV-5UTR或pGL3control-PRRSV-3UTR以及内参质粒pRL-TK共转染HEK-293T细胞，双荧光素酶活性检测结果表明ZAP不靶向PRRSV的5UTR和3UTR。 3.ZAP-L抑制PRRSV nsp7β，nsp9，nsp12的表达，而PRRSV nsp4能够切割ZAP 以前的研究报道ZAP-L还可以通过降解病毒的蛋白抑制流感病毒等病毒的增殖，为了探究ZAP-L能否通过同样的方式抑制PRRSV的增殖，将PRRSV非结构蛋白的真核表达质粒和Flag-ZAP-L共转染HEK-293T细胞，Western blot检测发现ZAP-L呈剂量依赖性抑制PRRSV非结构蛋白nsp7β，nsp9和nsp12的表达。同时我们还意外地发现PRRSV nsp4能够切割ZAP，并且PRRSV nsp4对ZAP的切割也呈剂量依赖性。 4.PRRSV nsp4对ZAP的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性 由于PRRSV nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶，具有切割活性，为了说明nsp4对ZAP的切割是否依赖其3C样蛋白酶活性，通过定点突变构建了其酶活突变体真核表达质粒(H39A，D64A，S118A)，将Flag-ZAP-L分别与PRRSV nsp4野生型及酶活突变体的真核表达质粒共转染HEK-293T细胞，Western blot检测发现PRRSVnsp4的酶活突变体不能切割ZAP，而野生型的nsp4可以切割ZAP，说明nsp4对ZAP的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性。进一步利用泛素-蛋白酶体途径、细胞自噬溶酶体途径和细胞凋亡途径的抑制剂检测发现，PRRSV nsp4切割ZAP不依赖细胞自噬、凋亡及蛋白酶体途径。 5.PRRSV nsp4识别ZAP第411位谷氨酸，且切割ZAP产生片段的抗病毒作用显著减弱 根据PRRSV nsp4识别底物P1位氨基酸的特点及其切割ZAP产生片段的大小，推测其切割ZAP的潜在位点有六个:E288，E329A，E334A，E371A，E411A，E453A。为了确定PRRSV nsp4切割ZAP的位点，通过定点突变构建了ZAP-L突变体的真核表达质粒(E288A，E329A，E334A，E371A，E411A，E453A)，将其与野生型ZAP-L的真核表达质粒分别与PRRSV nsp4的真核表达质粒共转染HEK-293T细胞，Western blot检测发现除了突变体E411不被切割外，其他几个突变体和野生型ZAP-L均被切割，说明PRRSV nsp4识别ZAP第411位谷氨酸。为了进一步探讨PRRSV nsp4切割ZAP的生物学意义，构建了ZAP-L被切割后产生的片段ZAP(1-411)和L(412-895)以及ZAP-S被切割后产生的C端片段S(412-779)的真核表达质粒，并与全长ZAP-L或者ZAP-S的抗PRRSV活性进行比较。结果发现，相对于全长ZAP-L或者ZAP-S，被切割片段抑制PRRSV增殖的能力显著减弱，表明PRRSV nsp4通过切割ZAP致弱其抗病毒活性。