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目的:建立灵芝甾醇一步式双水相分离提取方法,并研究灵芝甾醇的炎症抑制作用及其分子作用机制,为灵芝甾醇类活性物质的应用开发提供技术支持。方法:(1)选用小分子醇/无机盐双水相体系,对灵芝中的甾醇类物质进行一步式分离提取;以麦角甾醇为标志物,初步筛选适合的成相体系;分别考察亲水性有机试剂种类、无机盐(种类、浓度)、料液比、超声温度、超声时间对灵芝总甾醇提取得率的影响,确定适合灵芝总甾醇提取纯化的最佳体系;采取柱层析纯化灵芝甾醇单体化合物,对其进行鉴定和结构表征。(2)以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7使其产生炎症反应来研究灵芝甾醇的炎症抑制作用及其分子机制;MTT法测定不同剂量和作用时间对细胞增殖活力的影响;光学显微镜对细胞进行形态学观察;NO测定试剂盒测定细胞上清液中NO分泌量;ELISA试剂盒测定细胞上清液中细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌量;RT-PCR测定炎症因子的mRNA表达情况;Western-Blot测定NF-κB通路蛋白的表达情况。结果:(1)建立了灵芝甾醇正丙醇-碳酸钾双水相一步式分离体系,选择确定该体系的最佳条件为27.5%正丙醇、8.7%碳酸钾、料液比1:100、超声时间30min,在15~45℃的温度环境下均可进行操作,在此条件下灵芝总甾醇提取得率可达2.37mg/g,较传统酸碱转换法的1.45mg/g提高了38.8%。(2)将双水相提取得到的总甾醇组分进行柱层析,经凝胶柱、ODS柱纯化得到了2个单体化合物,经核磁、质谱鉴定为麦角甾醇(Ergosterol)和过氧化麦角甾醇(Ergosterol Peroxide,EP)。(3)细胞活力和细胞形态学的研究表明,与空白对照组相比,LPS处理组可明显改变RAW264.7细胞的形态(胞体增大、形态不规则、伪足大量伸出),EP(0.5~5μg/mL)干预后,可明显抑制LPS导致的细胞形态学变化;在0.5~5μg/mL的剂量范围内,EP单独或与1 mg/mL的LPS共培养作用于RAW264.7细胞,均未显示细胞毒性作用;麦角甾醇在0.01~10μg/mL的剂量范围内,表现出强烈的细胞毒作用,因此在后续炎症抑制研究中排除麦角甾醇,只对EP进行抗炎活性研究。(4)EP能够显著的抑制促炎症性细胞因子的表达和分泌,与LPS炎症模型组比较,EP干预后可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症性因子NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的释放,并呈剂量依赖关系;EP在0.5~5μg/mL剂量范围内可下调LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA相对表达。(5)Western-blot实验结果表明与正常组相比,LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,细胞内的NF-κB通路上的磷酸化p65和IκBα的蛋白表达显著升高。经EP(0.5、2.5、5μg/mL)处理后,炎症细胞内磷酸化p65和IκBα蛋白表达显著下降,说明EP对炎症细胞内磷酸化蛋白p65和IκBα的表达有抑制作用,EP炎症抑制作用的分子机制可能与NF-κB信号通路有关。结论:(1)研究提出的灵芝甾醇一步式双水相分离新技术选用正丙醇-碳酸钾双水相体系,是一种简单、高效分离灵芝总甾醇的新方法,可替代传统的酸碱转换法多步萃取方法,具有高效灵敏、准确可靠、可操作性强的特点。(2)灵芝EP对LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症具有抑制作用,灵芝EP能够降低RAW264.7细胞产生的炎症性细胞因子NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌,下调TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相对表达量。(3)灵芝EP对LPS刺激引起的RAW264.7炎症反应的抑制作用与NF-κB信号通路有关,其炎症抑制作用可能是通过阻止NF-κB信号通路的转导实现的。