【摘 要】
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目的:对乙酰氨基酚（N-acetyl-p-aminophenol,APAP）是一种有效的解热镇痛药,广泛应用于临床,但过量服用会诱导急性肝损伤（Acute liver injury,ALI）。NAD激酶（NAD kinase,NADK）作为限速酶,可将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）磷酸化生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicoti
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目的:对乙酰氨基酚（N-acetyl-p-aminophenol,APAP）是一种有效的解热镇痛药,广泛应用于临床,但过量服用会诱导急性肝损伤（Acute liver injury,ALI）。NAD激酶（NAD kinase,NADK）作为限速酶,可将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）磷酸化生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP+）,对细胞存活至关重要。课题组前期研究结果表明肝脏NAD+含量减少是APAP诱导ALI重要环节。因此,本实验旨在探索在APAP诱导的ALI中,NADK发挥的作用以及与NAD+含量减少的关系,为其治疗提供新靶点。方法:实验动物选用BALB/c雄性小鼠,腹腔注射给药。APAP给药后8小时收集眼球静脉血和肝组织（APAP时间梯度模型除外）。1.建立APAP诱导的剂量梯度（100 mg/kg,400 mg/kg）和时间梯度（4小时,8小时,24小时,48小时）ALI模型。检测血清转氨酶水平和肝脏NADK的蛋白表达情况,并对二者进行Spearman相关性分析。研究NADK表达与APAP诱导的ALI的关系。2.在APAP（400 mg/kg）给药后0.5小时,注射不同剂量（100,200 mg/kg）N-乙酰-半胱氨酸（N-acetyl-cysteine,NAC）。检测血清转氨酶水平和肝脏NADK的蛋白表达水平。研究解毒剂（抗氧化剂）处理后NADK的表达变化。3.在APAP（400 mg/kg）给药前,注射NADK的抑制剂甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）,10 mg/kg/天,连续5天。检测血清转氨酶水平;肝组织切片H＆E染色观察;检测肝组织丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的活性,NAD+和NADP+的含量,NADK的活性;检测NADK,沉默信息调节蛋白1（Silent information regulator type1,Sirt1）,SOD2的蛋白表达水平。研究抑制NADK对APAP诱导的ALI和氧化应激的影响。4.在APAP（400 mg/kg）给药前24小时、12小时、1小时注射NADK的底物NAD+（200,400或800 mg/kg）。检测血清转氨酶水平;肝组织切片H＆E染色观察;检测肝组织中MDA含量和SOD活性,检测还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性;检测肝脏NADK,Sirt1,SOD2,聚ADP-核糖聚合酶1（Poly（ADP-ribose）polymerase 1,PARP1）,磷酸化的H2AX组蛋白（Histone H2AX phosphorylated on Ser-139,γ-H2AX）,核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related,Nrf2）,Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1）,血红素氧合酶1（Heme oxygenase 1,HO-1）蛋白表达水平。研究直接补充NAD+对NADK和NAD+-依赖酶的影响。结果:1.NADK的表达与APAP诱导的ALI呈正相关。2.NAC减轻APAP诱导的ALI并降低NADK的表达。3.在APAP诱导ALI的模型中,MTX预处理:（1）降低血清转氨酶水平,减轻肝组织形态学损伤;（2）降低MDA含量,增加SOD活性;（3）抑制NADK的表达和活性,增加NAD+含量,激活Sirt1/SOD2信号通路。4.在APAP诱导ALI的模型中,NAD+预处理:（1）呈剂量依赖性地降低血清转氨酶水平;（2）减轻肝组织形态学损伤;（3）降低MDA含量,增加GSH含量,提高GSH-Px和SOD活性;（4）增加NADK的表达;（5）上调PARP1的表达,下调γ-H2AX的表达,减少DNA损伤;（6）激活Sirt1/SOD2信号通路;（7）激活Nrf2/HO-1抗氧化应激信号通路。结论:在APAP诱导ALI的过程中,NADK活化可能是一个加重损伤的因素。由于NADK过度活化,NAD+含量降低,肝细胞损伤加重,抑制NADK可能成为治疗APAP肝毒性的新策略。
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