【摘 要】
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D-2-羟基戊二酸（D-2-HG）是D-2-羟基戊二酸尿症（D-2-HGA）和异柠檬酸脱氢酶（IDH1和IDH2）突变相关癌症患者的标志性代谢物,其检测对于D-2-HGA及多种癌症的诊疗具有重要意义。目前,D-2-HG的常用检测方法主要包括液相色谱质谱联用（LC-MS）技术和气相色谱质谱联用（GC-MS）技术,不仅耗时、繁琐,还需要使用合适的衍生剂使D-2-HG与其手性异构体L-2-羟基戊二酸（L
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D-2-羟基戊二酸（D-2-HG）是D-2-羟基戊二酸尿症（D-2-HGA）和异柠檬酸脱氢酶（IDH1和IDH2）突变相关癌症患者的标志性代谢物,其检测对于D-2-HGA及多种癌症的诊疗具有重要意义。目前,D-2-HG的常用检测方法主要包括液相色谱质谱联用（LC-MS）技术和气相色谱质谱联用（GC-MS）技术,不仅耗时、繁琐,还需要使用合适的衍生剂使D-2-HG与其手性异构体L-2-羟基戊二酸（L-2-HG）区分开,限制了D-2-HG相关疾病诊疗技术的发展。细菌的转录调控因子能够感应各种小分子化合物,已作为生物识别元件被广泛用于开发检测各种小分子的生物传感器。本论文以来源于反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）NBRC 15125的转录调控因子DhdR为生物识别元件,结合不同的信号转换系统,开发了两种新型D-2-HG生物传感器,并将其应用于不同类型生物样本中D-2-HG的定量检测及D-2-HG相关代谢途径的研究。AlphaScreen技术是一种基于微珠的高灵敏度均相检测技术。本论文第二章通过荧光热迁移实验和等温滴定量热实验确定了转录调控因子DhdR的配体,发现D-2-HG可与DhdR特异性结合。随后利用DhdR的别构转录效应,将其与AlphaScreen技术相结合,开发了一个能够以浓度-依赖的方式响应D-2-HG的生物传感器,该生物传感器可将D-2-HG浓度转换为化学发光信号进行检测。通过对包含DhdR结合位点的生物素化DNA序列Bio-dhdO进行定点突变来改变DhdR与生物素化DNA序列间的亲和力,构建了 13个不同的Bio-dhdO突变体,实现对D-2-HG生物传感器灵敏度和检测范围的优化,获得了一个检测限0.10 μM和线性检测范围0.3-20 μM的传感器BD2HG-1。BD2HG-1具备较高的特异性、灵敏度和准确性,可有效地检测血清、尿液及细胞培养基等不同类型生物样本中的D-2-HG浓度,检测结果与LC-MS/MS相比具有较高的一致性。此外,使用BD2HG-1在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1中鉴定出一个新的D-2-HG合成酶WbpB,确定D-2-HG的积累会通过抑制WbpB活性来抑制脂多糖合成,揭示D-2-HG代谢在P.aeruginosa PAO1脂多糖合成中的作用。荧光共振能量转移（FERT）是一种发生在一对光敏感分子间的能量转移过程。本论文第三章以转录调控因子DhdR为生物识别元件,将DhdR插入至绿色荧光蛋白Clover和红色荧光蛋白mRuby2间,开发了一种基于FERT技术的比率型D-2-HG生物传感器。在500 nm的激发条件下,D-2-HG以剂量-依赖的方式降低传感器在600nm和515 nm处的荧光发射比值。采取对DhdR的N、C末端氨基酸截短以及添加人工linker的策略,实现了传感器响应幅度(ΔRmax)的优化,ΔRmax从最初的6.05%提高至25.28%。最优变体DHGFR1.0对D-2-HG具备较高的灵敏度与特异性,半最大效应浓度（EC50）为2.40 μM,动态检测范围为0.18-30.09 μM。另外,利用生物信息学手段预测了 DhdR的配体结合位点,通过对DhdR进行定点突变的方式降低传感器的亲和力,为实现D-2-HG胞内实时动态检测奠定基础。综上所述,本论文基于转录调控因子DhdR构建了两种不同的D-2-HG生物传感器,实现血清、尿液、细胞培养基及细胞裂解物等不同类型生物样品中D-2-HG的定量检测。基于所开发的生物传感器,在P.aeruginosa PAO1中鉴定出一条新的D-2-HG合成途径,揭示了 D-2-HG代谢在该菌株脂多糖生物合成中的作用。论文研究内容为突变后IDH抑制剂的筛选、D-2-HG代谢途径及相关疾病的诊断等研究提供了一种新的实验手段与方法,具有一定的应用价值。
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