目的：　　急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是临床上常见的急腹症，其中约15%～20%的急性胰腺炎患者可发展为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）[1]。SAP以胰腺出血坏死多见，起病急、进展快，临床病理变化复杂。由于SAP早期即可出现全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和多器官功能障碍综合征（multiple organs dysfunction syndrome，MODS），病死率高达30%～50%[2，3]，是临床胃肠道疾病患者死亡的主要原因。根据2012年修订的亚特兰大急性胰腺炎分级和分类系统，SAP被重新定义为除具备AP的临床表现和生物化学改变外，须伴有持续48 h以上的器官功能衰竭[4，5]。　　脓毒症（sepsis）是因感染而导致的宿主反应失调所引起的危及生命的器官功能障碍综合征[6]。脓毒症的病理生理过程分两个阶段，首先是由病原菌入侵引发机体感染和免疫失调，主要是以高炎症细胞因子为特征的过度炎症反应，即炎症风暴（cytokine storm）阶段；随后因免疫失调的持续，机体随即进入免疫抑制(immunosuppression)阶段，大部分患者会因继发二次感染和多器官功能障碍综合征而死于该阶段。　　近年来有研究表明，大多数SAP患者并非死于过度炎症反应，而常在晚期阶段会死于免疫抑制和细菌多重感染[7]。有人认为，SAP 晚期的继发细菌感染可能与其免疫抑制状态有关，但是，迄今为止尚未见有关SAP动物模型中是否存在从过度炎症反应状态向免疫抑制状态转变的过程以及免疫抑制转折点发生时间的报告。　　有文献报道，SAP 与脓毒症具有相似的炎症临床特征[8-10]。本课题组前期研究发现，CLP脓毒症小鼠模型中由过度炎症到免疫抑制的转折点为术后1天[11]。那么SAP动物模型中是否也存在从过度炎症反应到免疫抑制状态的转变过程以及免疫抑制转折点的发生时间，在本文中做了系统研究。　　实验性急性胰腺炎动物模型的建立方法有多种[12-14]，其中由胆酸盐所诱发的重症急性胰腺炎模型是广泛认可的代表性模型[15，16]。本研究采用胆胰管逆行注射牛磺胆酸钠的方法建立大鼠SAP模型，该方法可以在短时间内诱导胰腺的严重出血性坏死，能够反映SAP的病理生理过程和机制，并可通过给予不同浓度的牛磺胆酸钠复制出不同严重程度的SAP模型[12，14]。本研究在SAP大鼠模型建立的基础上，选用铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）作为二次打击病原菌来研究SAP大鼠的免疫抑制状态及由过度炎症反应到免疫抑制的转折点，为进一步研究SAP免疫抑制的病理生理过程及针对SAP不同病理生理阶段的治疗药物奠定基础。　　抗疟药青蒿琥酯(artesunate，AS)是二氢青蒿素的水溶性半琥珀酸盐衍生物，广泛应用于疟疾的治疗，具有疗效好、毒性低、安全性好的特点。最近，其多样的药理性质如抗炎作用，增强抗菌活性，抗肿瘤作用已被发现[17-21]。本课题组长期致力于青蒿琥酯临床新适应症的研究，前期研究发现AS对LPS耐受小鼠及CLP免疫抑制小鼠具有很好的治疗作用，而且对雨蛙素(caerulein，CR)联合脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致急性胰腺炎小鼠模型也具有很好的治疗作用[22-24]。　　因此，本研究首先采用微量注射泵通过胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠的方法建立大鼠重症急性胰腺炎模型；然后分别从大鼠对细菌的敏感性、细胞因子水平、细菌负荷及免疫细胞数量变化几个方面，系统研究SAP大鼠模型中过度炎症状态到免疫抑制状态的转折点；在此基础上观察青蒿琥酯对SAP免疫抑制大鼠的治疗作用，为进一步理解 SAP的病理生理过程、寻找针对 SAP 不同病理生理阶段的治疗药物及拓宽青蒿琥酯的临床新适应症提供实验依据。　　1. 大鼠 SAP 模型的建立：采用微量注射泵胰胆管逆行注射不同浓度牛磺胆酸钠的方法建立大鼠SAP模型，通过观察大鼠7天死亡率，筛选出可导致40%～70%死亡率的SAP模型建立方法。　　2. PA亚致死剂量的确定：大鼠尾静脉分别注射不同剂量的PA（1.0 ×108、2.0 × 108、4.0 ×108、8.0 ×108、1.0 ×109、1.0 ×1010、1.0 ×1011 CFU/kg，给菌体积0.2 mL/100 g体重），通过观察大鼠7天死亡率，筛选导致大鼠不出现死亡的PA亚致死剂量。　　3. SAP大鼠模型建立后不同时间点对PA的敏感性观察：将大鼠随机分为假手术组（开腹找出胰胆管后回纳腹腔，缝合）和 SAP 组。分别在 SAP 模型建立后的第 1天、第2天和第3天尾静脉注射给予亚致死剂量PA（4.0 ×108 CFU/kg，0.2 mL/100 g，下同）攻击，观察大鼠7天死亡率。为明确2天内不同时间点的动物死亡情况，分别在SAP模型建立后0、8、12、24、36、48 h尾静脉给予亚致死剂量PA，观察各组大鼠7天死亡率。　　4. SAP 大鼠免疫抑制转折点的确定：为确定 SAP 大鼠对 PA的高敏感性是由于过度炎症还是免疫抑制，将SAP大鼠随机分为假手术组和SAP组。分别在SAP模型建立后0、12和24 h尾静脉注射PA（4.0×108 CFU/kg）。PA注射后2小时取血和组织样品检测致炎细胞因子水平。　　5. SAP免疫抑制大鼠细菌清除能力的检测：大鼠SAP模型建立后24 h，尾静脉注射PA（4.0×108 CFU/kg），PA攻击后2 h，收集血液，肺和脾脏用于CFU菌落计数测定。血液，肺和脾脏组织匀浆连续稀释至适当浓度后，将100 μl稀释液加入MHA琼脂平板中，37℃培养18 h。使用G6全自动菌落分析仪记录琼脂平板的图像，并获得CFU计数。　　6. SAP免疫抑制大鼠致炎细胞因子的检测：采用相应的ELISA试剂盒测定TNF-α和IL-1β水平。样品收集在PA攻击后2 h；对于血液样品，收集血清用于细胞因子测定；对于组织样品，20%组织匀浆上清液用于细胞因子测定。　　7. SAP免疫抑制大鼠白细胞数量和分类的检测：大鼠SAP模型建立后24 h，尾静脉注射PA（4.0×108 CFU/kg），PA注射后2 h，收集血液于肝素抗凝管中，立即使用五分类动物血液分析仪测定白细胞的数量和分类百分比。　　8. SAP免疫抑制大鼠血清淀粉酶（amylase，AMS）和胰腺组织脂肪酶（lipase，LP）的检测：大鼠SAP模型建立后不同时相点，检测血清淀粉酶和胰腺组织脂肪酶的变化；同时检测SAP免疫抑制大鼠的血清淀粉酶和胰腺组织脂肪酶水平。　　二、 青蒿琥酯对SAP免疫抑制大鼠的治疗作用　　1. 观察青蒿琥酯对SAP免疫抑制大鼠及PA二次打击SAP免疫抑制大鼠的保护作用：模型建立后，给予AS治疗，每天2次，连续给药3天，观察PA二次打击SAP免疫抑制大鼠7天存活情况。　　2. 观察青蒿琥酯对SAP免疫抑制大鼠及PA二次打击SAP免疫抑制大鼠细胞因子释放水平的影响：ELISA法检测青蒿琥酯对大鼠致炎细胞因子TNF-α和IL-1β的影响。于模型建立后0、12、24 h分别给予AS治疗，共给药3次，样品收集在PA攻击后2 h，对于血液样品，收集血清用于细胞因子测定；对于组织样品，20%组织匀浆上清液用于细胞因子测定。　　3. 观察青蒿琥酯对SAP免疫抑制大鼠及PA二次打击SAP免疫抑制大鼠血细胞的影响：于模型建立后0、12、24 h分别给予AS治疗，共给药3次，同时模型建立后24 h尾静脉给予PA攻击，PA攻击后2 h，收集血液于肝素抗凝管中，立即使用五分类动物血液分析仪测定白细胞的数量和分类百分比。　　4. 观察青蒿琥酯对SAP免疫抑制大鼠及PA二次打击SAP免疫抑制大鼠细菌清除能力的影响：于模型建立后0、12、24 h分别给予AS治疗，共给药3次，同时模型建立后24 h尾静脉给予PA攻击，PA攻击后2 h，收集血液，肺和脾脏用于CFU菌落计数测定。血液及肺、脾组织匀浆连续稀释至适当浓度后，将 100μL 稀释液加入MHA琼脂平板中，37℃培养18 h。使用G6全自动菌落分析仪记录琼脂平板的图像，并获得CFU计数。　　结果：　　一、SAP大鼠免疫抑制模型的建立与评价　　1. 大鼠 SAP 模型的建立：采用不同浓度的牛磺胆酸钠成功建立具有不同死亡率的大鼠SAP模型，选择5%牛磺胆酸钠、0.2 mL/100 g、0.2 mL/min胰胆管逆行注射的方法成功建立48.1%死亡率的大鼠SAP模型。　　2. PA 亚致死剂量的确定：不同剂量的PA 攻击大鼠的死亡情况不同，成功筛选出PA攻击剂量4.0 ×108 CFU/kg为不能导致大鼠死亡的亚致死剂量，并用于后续的实验中。　　3. SAP模型建立后不同时间点大鼠对PA的敏感性不同：SAP模型建立后不同时间点（1天，2天，3天）给予亚致死剂量PA攻击，大鼠的死亡率不同，其中模型建立后第1天SAP大鼠对细菌的敏感性最高；2天内不同时间点大鼠对PA的敏感性结果显示，SAP术后0、8、12和24 h给予PA攻击大鼠，SAP+PA组死亡率均显著高于SAP组（P<0.05）。但是其高死亡究竟是过度炎症反应所致还是免疫抑制状态所致尚不能确定。　　4. SAP大鼠免疫抑制转折点的确定：SAP模型建立后0、12 h给予PA攻击，SAP+PA组和Sham+PA组TNF-α、IL-1β水平均较高且两组间无统计学差异（P>0.05）,表明0、12 h给予PA攻击SAP大鼠死于过度炎症反应；而24 h给予PA攻击，SAP+PA组TNF-α、IL-1β水平略高于Sham组但显著低于Sham+PA组（P<0.05或0.01），表明24 h给予PA攻击SAP大鼠致炎细胞因子水平较低，大鼠死于免疫抑制。以上结果表明，SAP模型建立后24 h是过度炎症反应状态到免疫抑制状态的转折点。　　5. SAP模型24 h给予PA攻击后大鼠的细菌负荷情况：平板计数结果显示，NS、Sham、SAP组大鼠血液及肺、脾脏中几乎无细菌检出，Sham+PA组的细菌负荷较高，但SAP+PA组的细菌负荷比Sham+PA组显著增加（P<0.01）。表明SAP模型建立后24 h，SAP大鼠的细菌清除能力明显低于Sham大鼠，大鼠处于免疫抑制状态。　　6. SAP模型建立后24 h给予PA攻击大鼠致炎细胞因子水平变化：SAP免疫抑制大鼠受PA攻击后，体内的致炎细胞因子水平(血清及脾、肺、肝脏中TNF-α、IL-1β)均显著低于Sham大鼠受PA攻击后致炎细胞因子水平，致炎细胞因子的释放处于抑制状态，再次表明SAP模型建立后24 h是大鼠处于免疫抑制状态。　　7. SAP模型建立后24 h给予PA攻击大鼠血液中白细胞数量和分型比例的变化：PA攻击 SAP 免疫抑制大鼠白细胞数显著降低，且淋巴细胞数和单核细胞数也均显著低于Sham+PA组（P<0.05）。表明白细胞数量的减少与SAP大鼠的免疫抑制密切相关。　　8. SAP免疫抑制大鼠及SAP大鼠不同时间点血清淀粉酶（amylase，AMS）和胰腺组织脂肪酶（lipase，LP）的检测：SAP大鼠血清淀粉酶活力在模型建立后2 h已开始上升，迅速上升至12 h达峰，而后迅速下降，72 h降至正常水平，胰腺组织脂肪酶活力呈现与血清淀粉酶相似结果；SAP 免疫抑制大鼠血清淀粉酶活力显著高于 Sham大鼠（P<0.01），且SAP+PA大鼠淀粉酶活力显著高于Sham+PA大鼠和SAP大鼠(P<0.05)；SAP免疫抑制大鼠胰腺组织脂肪酶活力显著高于Sham大鼠（P<0.05），而与SAP+PA大鼠和Sham+PA大鼠相比均无显著差异(P>0.05)。　　二、青蒿琥酯对SAP免疫抑制大鼠的治疗作用　　1. 青蒿琥酯能将重症急性胰腺炎模型大鼠生存率提高 23 个百分点，且能将 PA二次打击重症急性胰腺炎免疫抑制大鼠生存率提高20个百分点，提示青蒿琥酯对重症急性胰腺炎免疫抑制大鼠及 PA 二次打击重症急性胰腺炎免疫抑制大鼠具有一定保护作用。　　2. 青蒿琥酯能提高重症急性胰腺炎免疫抑制大鼠及PA二次打击重症急性胰腺炎免疫抑制大鼠致炎细胞因子TNF-α、IL-1β水平。　　3. 青蒿琥酯能一定程度增加重症急性胰腺炎免疫抑制大鼠及PA二次打击重症急性胰腺炎免疫抑制大鼠静脉血中白细胞、淋巴细胞和单核细胞的数量，但对白细胞分型百分比的影响较小。　　4. 青蒿琥酯可提高PA二次打击重症急性胰腺炎免疫抑制大鼠血液、肺和脾脏中铜绿假单胞菌的数量。　　结论：　　1. 采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠的方法成功建立了48.1%死亡率的SAP大鼠模型，该模型具有稳定性好、重复性高、操作简便且成功率高等优点，利于大批量进行实验。　　2. SAP模型建立后24 h是过度炎症状态到免疫抑制状态转折的时相点。在这个转折点，SAP大鼠呈现出更高的细菌敏感性、更高的细菌负荷和更低的致炎细胞因子水平。　　3. 青蒿琥酯可能降低 SAP免疫抑制大鼠及 PA二次打击 SAP免疫抑制大鼠的7天死亡率，提示青蒿琥酯对SAP免疫抑制大鼠可能具有治疗作用。　　4. 青蒿琥酯可显著增加SAP免疫抑制大鼠致炎细胞因子TNF-α、IL-1β的释放水平；并显著提高SAP免疫抑制大鼠对铜绿假单胞菌的清除能力；