健脾补肾法调控JAK2/STAT5信号通路治疗宫颈癌放化疗后骨髓抑制的机制研究

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目的:
  探讨健脾补肾法对宫颈癌患者同步放化疗所致骨髓抑制的干预效果,旨在为宫颈癌患者同步放化疗可能出现的骨髓抑制等毒副反应的预防?供参考和借鉴。
  方法:
  选取择期同步放化疗的脾肾两虚证宫颈癌患者160例为研究对象,随机分为观察组与对照组,每组各80例。两组患者均接受调强放疗(IMRT)、腔内照射,予以同步化疗。在放化疗前后,对照组采用肠道水化法预防骨髓抑制等毒副反应;观察组在对照组的基础上,给予健脾补肾法干预治疗。比较两组患者治疗前1天,治疗第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天的血常规、肝肾功能、炎性细胞因子、T淋巴细胞亚群水平;比较两组患者治疗前1天,治疗第14天、治疗第28天、治疗第42天的中医证候积分与KPS评分;治疗6个月后评价临床疗效,记录急性放疗相关不良反应和抗癌药物急性与亚急性毒副反应。
  结果:
  ①血常规水平
  治疗前1天,观察组与对照组WBC、Hb、PLT水平比较,差异均无统计学意义(t=0.11~0.96,P>0.05)。治疗第14天与治疗前1天比较,对照组WBC、Hb、PLT水平均显著降低(t=7.61~11.68,P<0.01);观察组WBC、Hb、PLT水平均不同程度的降低,但差异无统计学意义(t=1.05~2.00,P>0.05)。治疗第28天与治疗第14天比较,对照组Hb、PLT水平升高(t=3.86~5.01,P<0.05),观察组WBC、Hb、PLT水平均不同程度的升高,但差异无统计学意义(t=0.69~1.93,P>0.05)。治疗第42天与治疗第28天比较,两组WBC、Hb、PLT水平均不同程度的升高(t=3.96~5.27,P<0.05)。治疗第14天、治疗第28天、治疗第42天,观察组WBC、Hb、PLT水平均高于对照组相应水平,差异具有统计学意义(t=3.89~5.09,P<0.05)。
  ②骨髓抑制情况
  在有效受试者中,对照组51例患者出现不同程度的急性骨髓抑制,发生率为67.11%,其中三级、四级骨髓抑制16例,比例为21.05%。观察组25例患者出现不同程度的急性骨髓抑制,发生率为32.47%,其中三级、四级骨髓抑制7例,比例为9.09%。观察组三级、四级骨髓抑制发生率低于对照组水平(χ2=4.28,P<0.05),观察组总体骨髓抑制发生率显著低于对照组水平(χ2=18.36,P<0.01)。
  ③生化指标
  治疗前1天,观察组与对照组ALT、AST、BUN、Cr水平比较,差异均无统计学意义(t=0.17~0.56,P>0.05)。对照组中,治疗第14天与治疗前1天比较,ALT、AST、BUN、Cr水平均不同程度的升高(t=3.96~8.97,P<0.05或<0.01);治疗第28天与治疗第14天比较,ALT、AST、BUN、Cr水平均不同程度的降低,但差异无统计学意义(t=0.39~1.09,P>0.05);治疗第42天与治疗第28天比较,ALT、AST、BUN、Cr水平均不同程度的降低(t=3.83~5.17,P<0.05)。观察组后一时点与前一时点比较,差异均无统计学意义(t=0.13~1.21,P>0.05)。治疗第14天、治疗第28天,观察组ALT、AST、BUN、Cr水平均低于对照组相应水平(t=4.01~5.23,P<0.05);治疗第42天,两组间ALT、AST、BUN、Cr水平比较,差异均无统计学意义(t=0.27~1.36,P>0.05)。
  ④炎性因子水平
  治疗前1天,观察组与对照组血清TNF-α、IL-4、IL-6、IL-1β水平比较,差异均无统计学意义(t=0.00~0.61,P>0.05)。治疗第14天,两组患者血清TNF-α、IL-4、IL-6、IL-1β水平均显著升高(t=5.69~13.55,P<0.01);治疗第28天与治疗第14天比较,两组患者血清TNF-α、IL-4、IL-6、IL-1β水平不同程度的降低(观察组IL-4除外),但差异无统计学意义(t=0.97~2.12,P>0.05);治疗第42天与治疗第28天比较,两组患者血清TNF-α、IL-4、IL-6、IL-1β水平不同程度的降低(t=3.46~5.37,P<0.05)。治疗第14天、治疗第28天、治疗第42天,观察组血清TNF-α、IL-4、IL-6、IL-1β水平均低于对照组相应水平,差异具有统计学意义(t=3.39~9.33,P<0.05或P<0.01)。
  ⑤T淋巴细胞亚群水平
  治疗前1天,观察组与对照组全血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平比较,差异均无统计学意义(t=0.00~0.55,P>0.05)。治疗第14天,两组患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平均不同程度的降低(t=5.38~11.17,P<0.05或P<0.01);治疗第28天与治疗第14天比较,对照组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平不同程度的升高,但差异无统计学意义(t=0.86~2.05,P>0.05);观察组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平不同程度的升高(t=6.56~9.88,P<0.01)。治疗第42天与治疗第28天比较,对照组患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平均不同程度的升高(t=3.51~5.28,P<0.05);观察组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均不同程度的升高(t=3.68~5.51,P<0.05);CD8+水平降低,但差异无统计学意义(t=2.08,P>0.05)。除治疗第28天两组样本CD8+水平无统计学差异(t=1.89,P>0.05),治疗第42天观察组血清CD8+水平低于对照组水平(t=3.96,P<0.05)外,观察组治疗第14天、治疗第28天、治疗第42天全血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平均不同程度的高于对照组相应水平,差异具有统计学意义(t=4.51~15.09,P<0.05或P<0.01)。
  ⑥血清CEA、AFP水平
  治疗前1天,观察组与对照组血清CEA、AFP水平比较,差异均无统计学意义(tCEA=0.17,tAFP=0.25,P>0.05)。治疗第42天,两组患者血清CEA、AFP水平均不同程度的降低(t=5.62~10.53,P<0.05或P<0.01);治疗第42天,观察组血清CEA、AFP均低于对照组水平(tCEA=3.81,tAFP=3.64,P<0.05)
  ⑦中医证候积分
  治疗前1天,观察组与对照组中医证候积分比较,差异无统计学意义(t=0.63,P>0.05)。治疗第14天、治疗第28天、治疗第42天,观察组与对照组的中医证候积分均逐渐降低,且后一时点中医证候积分均低于前一时点,差异具有统计学意义(t=4.97~10.21,P<0.05或P<0.01)。治疗第14天、治疗第28天、治疗第42天,观察组中医证候积分均低于对照组水平,差异具有统计学意义(t=4.53~5.00,P<0.05)
  ⑧KPS评分
  治疗前1天,观察组与对照组KPS评分比较,差异无统计学意义(t=0.15,P>0.05)。按照治疗前1天、治疗第14天、治疗第28天、治疗第42天的顺序,对照组后一时点KPS评分均高于前一时点水平,但差异无统计学意义(t=0.33~1031,P>0.05);治疗第14天与治疗前1天比较,治疗第28天与治疗第14天比较,观察组后一时点KPS评分均高于前一时点水平(t=4.86~5.20,P<0.05),但观察组治疗第42天与治疗第28天的KPS评分比较,差异无统计学意义(t=0.67,P>0.05)。观察组治疗第14天、治疗第28天、治疗第42天的KPS评分均高于对照组相应时点的KPS评分,差异具有统计学意义(t=4.71~5.11,P<0.05)
  ⑨中医病证诊断疗效
  放化疗结束6个月后,对照组中治愈16例,显效28例,有效19例,无效13例,总有效率为57.89%(44例);观察组中治愈36例,显效34例,有效7例,无效0例,总有效率为90.91%(70例)。观察组治疗总有效率明显高于对照组(χ2=22.19,P<0.01)⑩不良反应
  除血常规、肝肾功能及骨髓抑制等不良反应外,两组其他不良反应以恶心呕吐、泄泻等消化道反应,以及尿路刺激症、尿潴留等泌尿系不良反应为主。其中,对照组发生恶心呕吐21例,泄泻5例,尿路刺激症5例,尿潴留3例,消化道不良反应发生率为34.21%,泌尿系不良反应发生率为10.53%。观察组发生恶心呕吐11例,泄泻3例,尿路刺激症3例,尿潴留1例,消化道不良反应发生率为18.18%,泌尿系不良反应发生率为5.19%。观察组消化道不良反应发生率低于对照组水平(χ2=5.09,P<0.05),而两组泌尿系不良反应发生率比较,差异并无统计学意义(χ2=1.50,P>0.05)
  结论:
  健脾补肾法应用于脾肾两虚证宫颈癌患者的同步放化疗具有较好的临床效果,不仅能够有效?高对脾肾两虚证宫颈癌的临床疗效,降低了机体的炎性反应,恢复了机体的免疫功能,而且减轻了同步放化疗所致的骨髓抑制程度,?升了患者的生活质量,这为宫颈癌患者的同步放化疗以及预防放化疗所致的骨髓抑制?供了参考和依据,具有一定的推广应用价值。
  第二部分健脾补肾法调控JAK2/STAT5信号通路对脾肾两虚骨髓抑制小鼠的影响
  目的:
  探讨健脾补肾法对骨髓抑制小鼠JAK2/STAT5信号通路的影响,旨在为骨髓抑制的干预乃至发病机制的阐释等?供依据。
  方法:
  选用C57BL/6雌性小鼠60只,随机分为空白组、模型组、中药组、西药组,每组各15只。采用环磷酰胺腹腔注射法,对模型组、中药组、西药组进行骨髓抑制模型制备。造模完成24h后,西药组给予rhG-CSF治疗,中药组给予健脾补肾方灌胃治疗,均连续7d。观察各组小鼠的一般状态,于末次给药后24h检测各组小鼠的外周血常规,CD3+T细胞、CD4+和CD8+T细胞亚群分类、Treg及NK数量,白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、EPO和GM-CSF水平;比较各组小鼠股骨骨髓组织病理学变化;PCR检测JAK2mRNA、STAT5mRNA、SOCS3mRNA表达,采用Western-blot实验检测JAK2、STAT5蛋白表达情况。
  结果:
  ①血常规分析
  与空白组比较,模型组小鼠外周血WBC、RBC、Hb、PLT数量均不同程度的减少(t=4.39~7.62,P<0.05或P<0.01),尤以WBC数量减少最为显著(t=7.62,P<0.01),这表明模型组小鼠经造模后,外周血三系血细胞数均减少,出现了骨髓抑制。与模型组比较,中药组和西药组小鼠外周血WBC、Hb、PLT数量均不同程度的增多(t=4.27~6.86,P<0.05或P<0.01)。西药组与中药组WBC、RBC、Hb、PLT数量比较,差异并无统计学意义(t=0.13~0.95,P>0.05);除WBC、PLT数量仍低于空白组(t=4.28~5.30,P<0.05)外,西药组与中药组RBC、Hb数量与空白组比较,差异均无统计学意义(t=0.27~0.81,P>0.05)。
  ②外周血免疫细胞亚群分析
  与空白组比较,模型组、西药组CD3+CD8+T、CD4+CD8+T、CD4/CD8不同程度的降低,模型组Treg、NK减少,差异具有统计学意义(t=4.53~6.98,P<0.05或P<0.01),说明模型组、西药组小鼠的免疫系统遭受了抑制。西药组、中药组CD3+CD8+T、CD4+CD8+T、CD4/CD8均高于模型组水平(t=4.45~5.17,P<0.05),这表明经过治疗,西药组、中药组小鼠的免疫功能均获得了?升。中药组CD3+CD8+T、CD4+CD8+T、CD4/CD8均高于西药组水平(t=4.37~5.00,P<0.05),这?示中药组小鼠的免疫功能高于西药组水平。空白组、西药组、中药组在Treg、NK方面比较,差异均无统计学意义(t=0.00~1.12,P>0.05)
  ③血清细胞因子水平
  与空白组比较,模型组小鼠血清中IL-3、IL-6及EPO、GM-CSF水平均不同程度的降低(t=4.75~6.88,P<0.05或P<0.01);与模型组比较,西药组、中药组IL-3、IL-6水平均升高,中药组EPO、GM-CSF水平亦升高(t=4.51~5.80,P<0.05);中药组小鼠血清中IL-3、IL-6及EPO、GM-CSF水平均高于西药组相应水平(t=4.39~5.27,P<0.05)。中药组与空白组血清中IL-3、IL-6及EPO、GM-CSF水平比较,差异均无统计学意义(t=0.31~1.35,P>0.05)
  ④股骨骨髓组织病理学变化
  空白组小鼠骨髓腔内,红细胞、粒细胞及巨噬细胞形态规则,分布均匀、密集,可见大量的造血细胞,?示骨髓组织功能活跃;模型组小鼠骨髓腔内,细胞分布稀疏,可见大量空泡,红细胞、粒细胞及巨噬细胞减少,并且伴有有核细胞的零散分布,说明骨髓受损较为严重,骨髓细胞增生被严重抑制;与模型组相比,西药组小鼠骨髓腔内,红细胞、粒细胞及巨噬细胞数增加,形态规则,分布均匀而且密集,仍然可以见到空泡存在,说明rhG-CSF对环磷酰胺诱导的小鼠骨髓抑制具有改善作用。与模型组相比,中药组小鼠骨髓腔内,红细胞、粒细胞及巨噬细胞数量增加,分布均匀而密集,并且存在较多的巨核细胞,血窦充血状况有明显改善,但仍可见空泡。
  ⑤血清细胞因子水平比较
  与空白组比较,模型组小鼠血清中IL-3、IL-6及EPO、GM-CSF水平均不同程度的降低(t=4.75~6.88,P<0.05或P<0.01);与模型组比较,西药组、中药组IL-3、IL-6水平均升高,中药组EPO、GM-CSF水平亦升高(t=4.51~5.80,P<0.05);中药组小鼠血清中IL-3、IL-6及EPO、GM-CSF水平均高于西药组相应水平(t=4.39~5.27,P<0.05)。中药组与空白组血清中IL-3、IL-6及EPO、GM-CSF水平比较,差异均无统计学意义(t=0.31~1.35,P>0.05)
  ⑥JAK2、STAT5及SOCS3mRNA表达
  与空白组比较,模型组、西药组骨髓干细胞JAK2mRNA、STAT5mRNA表达均不同程度的降低,SOCS3mRNA表达均不同程度的升高(t=4.52~7.53,P<0.05或P<0.01);中药组JAK2mRNA、STAT5mRNA、SOCS3mRNA表达变化无显著差异(t=0.21~1.13,P>0.05);西药组、中药组JAK2mRNA、STAT5mRNA表达均高于模型组水平,SOCS3mRNA表达低于模型组水平(t=4.40~7.31,P<0.05或P<0.01);中药组JAK2mRNA、STAT5mRNA表达高于西药组相应水平,SOCS3mRNA表达低于西药组水平(t=4.37~4.66,P<0.05)
  ⑦pJAK2、pSTAT5蛋白表达
  与空白组比较,模型组、西药组骨髓干细胞pJAK2、pSTAT5蛋白表达均不同程度的降低(t=4.83~6.92,P<0.05或P<0.01);但空白组与中药组pJAK2、pSTAT5蛋白表达比较,差异均无统计学意义(tpJAK2=0.29、tpSTAT5=1.06,P>0.05)。与模型组比较,西药组、中药组pJAK2、pSTAT5蛋白表达均不同程度的升高(t=4.72~6.85,P<0.05或P<0.01);中药组pJAK2、pSTAT5蛋白表达均高于西药组相应水平(tpJAK2=3.69、tpSTAT5=4.20,P<0.05)
  结论:健脾补肾法能有效?高骨髓抑制小鼠的外周血细胞数量,增强免疫功能,调节炎症反应机能,增加JAK2、STAT5mRNA及JAK2、STAT5蛋白表达,健脾补肾法改善小鼠骨髓抑制的机制可能与其调节JAK2/STAT5表达有关。
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