近年来由于多种因素的作用,卵巢癌的发病率在逐年上升,且卵巢的解剖学位置较深,其发病早期不易被发现,在治疗过程中极易对化疗药物产生耐药性,手术治疗后极易复发,综合这些特点使卵巢癌成为妇科恶性肿瘤中致死率最高的恶性肿瘤,晚期卵巢癌5年生存率仅20%-30%,严重影响着女性病人的生存质量及寿命。因此研究卵巢癌的发病机制、寻找新的有效治疗卵巢癌的靶点,对卵巢癌诊断、治疗和预防手术后复发有着非常重要的意义。miRNA是长度22nt左右的非编码小RNA,通过与多种靶基因nRNA的3’UTR不完全互补结合,降解靶基因,达到对这些基因负向调控的目的,从而调节机体相应的生理功能,如细胞分化、增殖等,且其可以在肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因的作用,调控人类肿瘤的发生发展。DGCR8是位于人类22号染色体q11.2区域的一个等位基因,因其与迪乔治综合症(Digeorge Syndrome, DGCS)相关,故命名为DGCR8。 DGCR8包括两个RNA结合区,在miRNA的合成过程中,它不仅可以结合pri-miRNA,还可以通过与Drosha相互作用和稳定微处理器复合物来促进Drosha的切割作用,调控miRNA的生成,影响miRNA对基因的调控作用。由此可见DGCR8是参与miRNA合成与成熟的重要蛋白。目前研究发现DGCR8参与人类多种疾病的发生,干预DGCR8的表达可以作为疾病研究的模型。众多的研究报道显示DGCR8的异常可以引起miRNA的表达发生改变,从而参与肿瘤的发生发展,影响肿瘤的预后。因此我们设想沉默卵巢癌细胞系中DGCR8的表达,分析研究其对卵巢癌的影响,以期为卵巢癌的诊断和治疗提供新的发病机制和靶点。目的1体外实验研究DGCR8对卵巢癌细胞系SKOV3的影响(抑癌基因或者癌基因),同时筛选沉默DGCR8表达改变引起的SKOV3细胞系中miRNA表达谱的变化,分析DGCR8在卵巢癌中发挥作用的分子生物学机制,为卵巢癌的诊断和治疗奠定基础。2动物实验,进一步为DGCR8作为卵巢癌诊断指标的可行性奠定分子生物学基础。3分析研究DGCR8在卵巢癌组织中的表达,评估DGCR8作为卵巢癌诊疗标记物的可行性。方法1细胞培养本课题研究中使用的人卵巢癌细胞株SKOV3购自美国菌种保藏中心,培养液为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基,置于37℃、5%C02的恒温培养箱中培养,每2-3天传代一次。2免疫荧光染色检测DGCR8在SKOV3细胞中的表达情况将SKOV3细胞和沉默DGCR8表达的SKOV3细胞在24孔板培养后,苯甲醛固定细胞,加入DGCR8一抗过夜,第二天PBST洗涤3遍,加入兔荧光二抗1小时,PBST洗涤3遍,同时在24孔板滴加DAPI染色液进行核染色,荧光显微镜下观察两组荧光强弱并拍照。3蛋白印迹法检测DGCR8和细胞生长增殖相关信号通路p-AKT、p-ERK的表达情况将SKOV3细胞和沉默DGCR8表达的SKOV3细胞培养,收获细胞,洗涤,在l×蛋白裂解液(RIPA)中裂解；采用蛋白印迹法检测细胞DGCR8、p-AKT和p-ERK蛋白的表达强度,以GAPDH为内对照。4MTT、细胞计数和细胞集落形成实验研究细胞生长增殖速度MTT：用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液将SKOV3(对照组)和沉默DGCR8(实验组)表达的SKOV3细胞,配成细胞悬液,吹打均匀,按每孔8000个细胞接种在96孔板,培养96h后,每孔加入10μ1的四甲基偶氮唑蓝(MTT,5mg/m1)溶液,继续培养4h后,加入100u1的去垢剂。置于多功能酶标仪中,于570nn波长处测定其吸光度(A)值。细胞计数：实验组和对照组细胞,以每孔5x104个细胞接种在6孔板,于24、48、72、96小时各计数一次,比较实验组和对照组细胞的生长速度。细胞集落实验：实验组和对照组细胞按每孔200个细胞接种于6孔板,每2-3天换液一次,2周后固定结晶紫染色,分析比较两组细胞集落大小及数目。5细胞迁移划线,transwell侵蚀小室和软琼脂集落形成实验(soft agar)分析研究细胞的迁移和侵袭能力细胞迁移划线：实验组和对照组各5x105个细胞一式三份平铺在六孔板上过夜,第二天用20u1的枪头划线,PBS洗3遍,记为0小时,光学显微镜下照相,继续培养24小时后PBS洗三遍,显微镜下照相,比较0小时和24小时细胞迁移的面积,分析两组细胞的迁移速率。细胞侵袭Transwell侵蚀小室：1x105个细胞用含1%胎牛血清的DMEM培养液培养,种在上小室的基底膜基质上,下室加入含10%胎牛血清的DMEM,培养24小时。荧光显微镜下照相,比较两组细胞的侵袭能力。软琼脂集落形成实验：1.2%的琼脂和2xDMEM混合加入六孔板中,每孔lml,作为上胶,待琼脂凝固。2×106个细胞和0.7%的琼脂混合加入六孔板作为上胶,待上胶凝固后,加入2m1含10%胎牛血DMEM。每5天换液一次,2周后在显微镜下对细胞集落进行计数。6Caspase3/7.WST-1检测药物诱导的SKOV3和沉默DGCR8表达的SKOV3凋亡和药物对细胞的毒性Capases3/7细胞凋亡：每孔8000个细胞种在96孔板上,培养24小时,PBS洗一遍,细胞饥饿1小时,不同浓度的顺铂处理细胞24小时,Caspase3/7检测细胞的凋亡。WST-1：SKOV3和沉默DGCR8表达的SKoV3细胞按每孔5×104个细胞,接种在96孔板,用含10%FBS的DMEM完全培养基培养24小时后,加入不同浓度的顺铂,37℃处理24小时后,每孔加入10u1的WST-1试剂3小时,酶标仪检测药物对细胞的毒性。7miRNA表达谱分析卵巢癌细胞株SKOV3和DGCR8低表达SKOV3,用TRIzol(?) Reagent收集细胞总的RNA,采用miRNAarray,检测细胞miRNA的表达谱变化,Realtime-PCR随机挑选发生改变的miRNA进一步验证miRNAarray的结果。8动物实验选用3-4周左右的雌性NSG小鼠10只,建立移植瘤小鼠模型。5×106SKOV3和沉默DGCR8表达的SKOV3细胞系小鼠皮下注射,每组5只。每3天测一次肿瘤大小,持续8周。每天检查小鼠健康状况和肿瘤生长情况。9免疫荧光法检测卵巢癌患者癌组织中DGCR8和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况收集卵巢癌和正常卵巢组织(每组10例),制成组织芯片(制作单位：郑州大学第三附属医院病理科),免疫荧光染色,具体如下：取厚度为4μm的组织切片采用二甲苯脱蜡15min,100%的乙醇浸泡5min；95%和70%的乙醇中分别浸泡5min水化,3%过氧化氢甲醇中孵育10min；消除内源性过氧化物酶活性,在煮沸的抗原修复液中修复抗原30min；常温下磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.5)洗3次,在含5%Goat serum和1%FBS的PBS中孵育1h以封闭蛋白。DGCR8和PCNA抗体用含1%FBS和5%Goat serum的溶液按1：200稀释,4度房过夜；次日PBS洗3次,每次2min。兔抗DGCR8和鼠抗PCNA免疫荧光二抗用含1%FBS和5%Goat serum的溶液按1：500稀释,孵育1h。荧光显微镜下拍照。10统计学分析统计学处理应用SPSS17.0数据包,数据分析采用t检验,比较两样本均数,每组实验数据均重复三次后进行统计学分析,实验数据以x±s的形式来表示检验水准α=0.05。结果1.沉默DGCR8的表达,细胞的生长增殖、迁移、侵袭能力受限,细胞凋亡增加。2.沉默DGCR8的表达,细胞miRNA表达谱发生了改变。3.沉默DGCR8的表达,抑制小鼠移植瘤的生长速度。4.卵巢癌组织中DGCR8的表达高于正常卵巢组织。结论1. DGCR8在卵巢癌组织中高表达,促进卵巢癌的发生、发展,有望作为卵巢癌治疗的重要靶点。2.沉默DGCR8的表达可有效阻断卵巢癌中细胞信号传导通路P-ERK、P-AK以及miRNA表达谱的变化,为卵巢癌发病提供新的分子生物学机制,具有巨大的应用潜力。