论文部分内容阅读
目的研究细胞穿透肽(cell penetrating peptide,CPP)PEP-1介导铜,锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-superoxide dismutase,SOD1)在小鼠大脑皮质的跨膜转导能力以及转导的时间关系;研究单独应用PEP-1-SOD1融合蛋白预处理以及联合应用银杏叶提取物(GinkoBiloba Extract,GBE)预处理时对小鼠脑梗死后神经元的保护作用;探讨其对神经元凋亡的影响以及可能存在的保护机制。方法(1)取体质量35～40g的雄性昆明小鼠随机分成两组(n=75):SOD1组以及PEP-1-SOD1组。每组小鼠分别腹腔注射200 ug的SOD1蛋白和PEP-1-SOD1融合蛋白,在1h、2h、4h、8h以及24h时间点取脑组织行相关指标检测:Western blot测定外源性SOD1表达,免疫荧光化学法测定SOD1定位以及分布,黄嘌呤氧化酶法测定SOD1活性;(2)小鼠随机分为假手术组、模型组、PEP-1-SOD1组、GBE组以及联合组(n=15),建立永久性大脑中动脉闭塞(permanent middlecerebral artery occlusion,PMCAO)模型。手术前30 min,假手术组及模型组腹腔注射生理盐水200ul,PEP-1-SOD1组注射PEP-1-SOD1融合蛋白200ug,GBE组注射舒血宁注射液35mg/kg,联合组注射PEP-1-SOD1融合蛋白200ug以及舒血宁注射液35mg/kg。24h后取小鼠脑组织进行相关指标检测:①TTC染色测定梗死体积;②黄嘌呤氧化酶法测定SOD1活性,TBA法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;③末端脱氧核糖核酸酶转移介导的dUTP缺口末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)测定细胞凋亡;④免疫荧光化学法测定凋亡相关基因bax和bcl-2表达。结果(1)在SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白的转导实验中:①Western blot结果显示药后1h,PEP-1-SOD1组小鼠大脑皮质在分子量约26KD处出现目的蛋白表达条带,4h达高峰,24h仍有蛋白表达;而SOD1组的小鼠脑组织未能检测到目的蛋白表达;②免疫荧光化学结果显示PEP-1-SOD1组小鼠大脑皮质给药后1h出现特异性绿色荧光,4h时荧光最强,24h仍可见绿色荧光;而SOD1组小鼠大脑皮质任何时间点均未发现绿色荧光;③SOD1活性检测结果提示PEP-1-SOD1组小鼠大脑皮质给药后1h SOD1活性升高,4h达高峰,24h时仍明显高于SOD1组。结果证明PEP-1-SOD1融合蛋白可以转导进入小鼠大脑皮质,且转导入脑组织的SOD1具有酶的活性;而单独的SOD1则不能进入中枢神经系统。(2)在对脑梗死后神经元的保护作用实验中:①TTC染色显示PEP-1-SOD1组梗死体积缩小(P＜0.05 vs模型组),联合组梗死体积则明显缩小(P＜0.01 vs模型组),但PEP-1-SOD1组与联合组之间未见统计学差异(P＞0.05);②SOD1活性以及MDA含量检测显示脑梗死后24h模型组SOD1活性明显下降,MDA含量升高(P＜0.01 vs假手术组);PEP-1-SOD1组以及联合组SOD1活性升高,MDA含量下降(P＜0.01vs模型组),但此二组之间未见统计学差异(P＞0.05);③脑梗死后24h,TUNEL染色显示模型组凋亡细胞增多,bax表达阳性细胞较多而bcl-2阳性细胞表达较少(P＜0.01 vs假手术组);PEP-1-SOD1组凋亡细胞减少,bax表达阳性细胞下降而bcl-2阳性细胞表达升高(P＜0.01 vs模型组);联合组细胞凋亡、bax表达阳性细胞进一步减少,bcl-2表达阳性细胞进一步增多(P＜0.05 vs PEP-1-SOD1组)。结论(1)PEP-1可以介导SOD1以天然活性形式转导入中枢神经系统,单独应用SOD1不具备跨膜转导能力;(2)PEP-1-SOD1融合蛋白预处理对梗死后神经元具有明显的保护作用。(3)联合应用PEP-1-SOD1以及GBE后对神经元的保护具有协同作用。(4)PEP-1-SOD1融合蛋白能减轻脑梗死后神经元凋亡,其机制可能与上调bcl-2表达,下调bax表达以及bax/bcl-2比值有关。