论文部分内容阅读
MiRNAs是一类内源性长度22个核苷酸的非编码小RNA。近年来,关于miRNAs的研究涉及各个领域,包括机体正常发育、疾病发生和肿瘤形成等。骨骼肌发育主要涉及肌卫星细胞的激活与增殖、成肌细胞的分化、肌管的形成等。骨骼肌发育的各个阶段受到许多miRNAs的调控,如miR-1、miR-133、miR-181、miR-206、miR-17-92、miR-34、mi R-127、miR-432等。可见,miRNA在肌肉的发育过程中发挥着重要的作用。本文旨在研究miR-106a-5p对C2C12成肌的作用及潜在机制。本实验以小鼠C2C12细胞系为实验材料,鉴于miR-106a-5p在成肌分化过程显著下调,采用miRNAs模拟物（agomir）过表达技术,研究其对C2C12细胞成肌的作用及潜在调控机制。通过生物信息学分析软件,预测miR-106a-5p的潜在靶基因,并构建双荧光素报告载体进行验证。获得主要结果如下:1.MiR-106a-5p阻滞AKT信号抑制C2C12细胞分化过表达mi R-106a-5p抑制C2C12成肌分化,分化指数、多核肌管的数目显著降低（P<0.05）,肌管形态比较细短;成肌标志基因MyoD、MyoG、MyHC显著降低（P<0.05）;融合相关基因Myomarker、Myomixer显著下调（P<0.05）。此外,AKT磷酸化水平被抑制（P<0.05）;相反,IGF1激活AKT信号后,促进成肌分化（P<0.05）,且IGF1可以恢复miR-106a-5p对C2C12成肌分化的抑制作用（P<0.05）。2.MiR-106a-5p促进C2C12细胞增殖转染mi R-106a-5p后,细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE、CyclinB的表达水平显著上调（P<0.05）,增殖细胞核抗原PCNA表达增加（P<0.05）,DNA复制能力加强,促进细胞G1期向S期的转化（P<0.05）。3.MiR-106a-5p抑制AKT信号促进C2C12肌管萎缩。MiR-106a-5p在Dex诱导的肌管萎缩模型及老龄小鼠（6月龄）中表达上调。在C2C12完全分化后（分化5 d左右）,转染miR-106a-5p诱导肌管萎缩,肌管直径显著降低（P<0.05）;萎缩相关基因MAFbx mRNA显著上调（P<0.05）,而MuRF1 mRNA变化不显著（P>0.05）,但两者的蛋白水平均显著上调（P<0.05）。此外,miR-106a-5p在肌管萎缩过程中,抑制PI3K-AKT信号。4.E2F3、SP-1和PIK3R1是miR-106a-5p调控成肌的靶点。过表达mi R-106a-5不影响分化期E2F3、SP-1 mRNA的表达,但显著降低其蛋白水平（P<0.05）;此外,miR-106a-5p显著下调分化及分化后期PI3K（p85α）蛋白的表达（P<0.05）。构建psi-Check2-E2F3、psi-Check2-SP-1及psi-Check2-PIK3R1双荧光素报告载体,发现miR-106a-5p显著降低其野生型载体的活性（P<0.05）。综上所述,miR-106a-5p在分化及分化后水平,能特异性靶向PIK3R1来阻滞PI3K-AKT信号通路,从而抑制C2C12成肌分化,并诱导C2C12肌管的萎缩。此外,mi R-106a-5p可以促进C2C12细胞的增殖,并在分化期特异性靶定E2F3、SP-1转录因子。