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猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(PRV)引起猪的以发热、奇痒和急性脑脊髓炎等为典型症状的急性热性传染病。猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(EMCV)引起猪的以脑炎、心肌炎为主要临床特征的急性传染病。本研究在PRV闽A株(Fa株)gB、gC、gD基因克隆和序列测定的基础上，构建了表达gB、gC、gD基因的重组质粒和表达gC基因的重组腺病毒，分析了重组质粒与全病毒灭活疫苗联合免疫和重组腺病毒的免疫效果，探讨了重组腺病毒免疫制备gC蛋白单克隆抗体的可行性；构建了分别表达EMCVP1和P12A与3C蛋白酶基因串联的重组腺病毒，并在小鼠分析了免疫保护效果。
对PRV Fa株gB、gC、gD基因的克隆和序列测定结果表明，gB、gc、go基因序列全长分别为2745 bp、1464 bp、1215 bp，分别编码914 aa、487 aa、404 aa的多肽；与其它毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的同源性为94.9％-99.9％，氨基酸序列的同源性为91.4％-99.9％，提示gB、gC、go基因在不同PRV毒株间高度保守。基于gB、gC、go基因的进化分析表明，中国分离毒株与韩国分离毒株可归为一个进化分支，Fa株与Ea株的亲缘关系很近，3个基因的同源率均在99.5％以上；而日本分离毒株与欧美分离株归为另一分支。与欧美分离毒株相比，我国分离株(Ea株、Fa株)gB蛋白氨基酸全长多1个氨基酸，氨基酸残基的突变主要集中在第50-100 aa区域内；gC基因序列的第186-211 bp之间有21个碱基插入；gD蛋白多2个以上氨基酸，在gO基因序列的第803-837 bp之间，Fa株核苷酸AGGCCC串联重复达到7个。
采用Prime-boost免疫策略，将表达PRV gB、gC、gD基因重组质粒DNA(Mix DNA)、gC基因重组质粒DNA(gC DNA)与油乳剂灭活苗(KV)联合免疫BALB/c小鼠。对体液免疫和细胞免疫指标的测定结果表明，Mix DNA免疫2次与Kv加强免疫1次的组合抗原特异性淋巴细胞增殖(MTT)和足垫迟发型超敏反应(DTH)应答水平最高，中和抗体水平比单独。Mix DNA免疫3次组明显升高，接近KV免疫2次组；gC DNA免疫2次与KV加强1次组的中和抗体水平比gC DNA免疫3次组明显升高，细胞免疫水平比KV免疫2次组明显增强，但均低于Mix DNA免疫和KV加强组。用20 LD<,50> PRV攻毒结果表明，Mix DNA或gC DNA免疫-KV加强组、KV单独免疫组的小鼠均获得了100％保护(10/10)，而重组质粒单独免疫组小鼠保护率为80％-90％(8/10-9/10)。由此说明，PRV重组质粒初免与灭活苗加强的免疫策略可以明显提高重组质粒单独免疫的体液和细胞免疫效果以及灭活苗的细胞免疫效果。
经双酶切将PRv Fa株gC基因亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中，获得pDC316-gC，与腺病毒DNA辅助质粒pBHGlox△E1，3Cre共转染293细胞，成功包装出重组腺病毒Ad-gC。经PCR鉴定和病毒空斑纯化，得到纯的高效价重组病毒Ad-gC。间接免疫荧光试验证实获得的重组腺病毒能表达PRV gC蛋白。用重组腺病毒免疫BALB/c小鼠，结果表明能诱导特异性的体液和细胞免疫反应。一免和二免后两周的gC蛋白抗体ELISA效价分别为7680±2862和112640±56086，病毒中和效价分别为14±4和48±18，而对照组均为阴性。二免后两周测定DTH应答水平，Ad-gC免疫组小鼠足垫呈现不同程度红肿，与对照组足垫肿胀值相比差异极显著(P<0.01)。用20 LD<,50> PRV攻毒结果表明，Ad-gC免疫组小鼠可获得100％保护(8/8)，对照组为0％(0/8)。
将表达PRV gC基因的重组腺病毒和重组质粒DNA组合，免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术获得9株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1C8、1D1、1H7、2D7、2G7、1A12、184、1H4和2C8)，其小鼠腹水抗体效价为1:2×10<5>-1:5×10<6>。亚类鉴定结果表明，单抗1A12、1H4、1H7、2C8、2D7为IgG2a，lC8为IgG2b，184、1D1、2G7为IgGl。经间接免疫荧光试验和Western blotting分析表明，9株单抗均能与PRVgC蛋白反应，且识别gC蛋白的线性表位。以上结果表明，重组腺病毒免疫可用于制备抗目的蛋白单克隆抗体，为制备单抗提供了一种新的免疫方法。
将脑心肌炎病毒核衣壳前体多肽P1与P12A3C串联基因分别插入穿梭质粒pDC316中，构建出重组穿梭质粒pDC316-P1和pDC316-P12A3C，分别与辅助质粒pBHGloxAE1，3Cre共转染293细胞，成功包装出重组腺病毒Ad-P1和Ad-P12A3C。获得的重组腺病毒可稳定传代。免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和Western blotting分析表明，重组病毒可表达目的蛋白。用重组腺病毒免疫小鼠，结果表明Ad-P1诱导的VP1特异总抗体IgG和DTH免疫水平均高于Ad-P12A3C，然而Ad-P1并不能检测到明显的中和抗体(<1:8)。Ad-P12A3C能诱导产生较高水平的中和抗体(1:32-128)，无论一次或二次免疫后对10<8>TCID<,50> EMCV攻毒均能获得100％的保护(8/8)，一免后7 d小鼠即能完全抵抗EMCV病毒的攻击。用10<8>TCID<,50>的Ad-P1免疫小鼠2次，对10<7>TCID<,50>EMCV攻毒可获得100％的保护(8/8)。以上结果显示，构建的重组腺病毒Ad-P12A3C能诱导产生良好的免疫保护，具有开发成EMCV重组腺病毒活载体疫苗的潜力。