芍药种子中α-亚麻酸生物合成相关基因的克隆与表达

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植物油脂中的脂肪酸与人体健康具有密切联系,根据其饱和度可分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸;多不饱和脂肪酸又可分为n-3和n-6等系列。其中,α-亚麻酸(ALA)为植物源性n-3脂肪酸,是人体必需脂肪酸,在调节血脂、降低血压和血糖,预防癌症等,抗炎症,增强免疫力,保护视力和提高记忆力等方面具有重要作用。因此,挖掘富含ALA的芍药种质资源,明晰调控ALA生物合成的关键基因以及其合成与调控的分子机制,可以为今后选育优良品种以及通过遗传工程提高芍药籽油ALA含量奠定理论基础。为此,本论文利用GC.MS技术测定了9个芍药品种脂肪酸成分及其相对含量,明确了不同发育时期脂肪酸相对含量的变化,筛选出ALA含量差异显著的两个品种‘PL1’和‘PL2’:运用RACE技术克隆了7个与种子中ALA合成相关基因,分析了2个芍药代表品种‘PL1’和‘PL2’形成过程中ALA含量变化及其相关合成基因表达的差异,主要结果如下:(1)利用GC.MS技术分析了9个芍药品种的脂肪酸成分,鉴定出了15种脂肪酸成分:月桂酸(C12:0)、豆蔻酸(C14:0)、十五烷酸(C15:0)、棕榈酸(PA,C16:0)、棕榈一烯酸(C16:1)、十七烷酸(C17:0)、十七碳一烯酸(C17:1)、硬脂酸(SA,C18:0)、油酸(OA,C18:1)、亚油酸(LA,C18:2).ALA(C18:3)、10-十九烯酸(C19:1)、花生酸(C20:0)、花生一烯酸(C20:1)、花生二烯酸(C20:2)。种子成熟时期,籽油中总不饱和脂肪酸占到总脂肪酸的90%以上,其中相对含量超过1%的脂肪酸有5种:LA(33.44%±3.45%)、OA (32.66%±1.78%)、ALA(26.79%±2.75%)、PA(5.1%±0.84%)和SA(1.44%±0.87%)同时,对9个品种不同发育时期脂肪酸含量的变化进行了分析,在‘PL1’种子发育过程中,籽油中ALA的相对含量不断下降,S1时期时为最大值(43.76%±6.87%),S4时期下降到最低值(34.49%±1.53%)。与之相反,OA的相对含量不断升高,Sl时期为20.70%±0.21%,在S4时期达到最高值30.01%±0.48%,LA的相对含量也基本呈增长趋势,只是在S3时期稍有下降,从S1时期的28.35%±8.49%逐渐增加到S4时期的30.13%±1.53%。其他8个芍药品种籽油中的脂肪酸均呈现相似的变化趋势。(2)以‘杭芍’种子中所提取的RNA为模板,根据Genbank中其他植物已登陆的相关基因序列设计引物,克隆了芍药种子中与ALA生物合成相关的7个基因(PlSAD、PlFAD2-1、 PlFAD2-2、PlAD3-1、PlFAD3-2、PlFAD6和PlFAD7),其cDNA全长分别为1570bp、1452b p. 1466bp、865bp、1685bp、1417bp和1782bp,相应地编码395、383、384、281、435、409、和448个氨基酸,且其编码的氨基酸序列与其他植物存在较高的的一致性和相似性。基因登录号分别为KJ441080、KJ441081、KP271029、KR605462、KM575841、KP271030和KP271031。(3)通过对9个芍药品种籽油的脂肪酸进行分析,筛选出ALA含量差异最显著的两个品种‘PL1’和’PL2’,’PL1’籽油中ALA含量最高(34.49%±1.53%),‘PL2’籽油中ALA含量最低(20.08%±-1.22%)。同时,通过Q-PCR技术分析了两个品种(‘PL1’和‘PL2’)种子4个不同发育时期PlSAD、PlFAD2-1、PlFAD2-2、PlAD3-1、PlFAD3-2、PlFAD6和PlFAD7共7个相关基因的表达水平。结果表明,7个相关基因在种子中均能被检测到,且各个基因表达结果与脂肪酸含量变化趋势较为一致,ALA含量相对较高的‘PL1’品种的基因表达普遍高于ALA含量相对较低的‘PL2’品种。其中,导致ALA积累水平不同而使‘PL1’和‘PL2’两个芍药品种ALA差异的关键基因是合成途径中上游的PlSAD、 PlFAD2-2和PlFAD3-1基因的高水平表达,使‘PL1’中积累了较多的ALA的前体物质。
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