论文部分内容阅读
MAN2C1是本实验室克隆的cDNA编码的1个人α-甘露糖苷酶。我们原先称它为6A8α-甘露糖苷酶。国际已命名此酶为mannosidase,alpha,class2C,member1[Homosapiens],简称MAN2C1。其相应的基因位于染色体15q11-q13。HUGO基因命名委员会命名此基因为MAN2C1。MAN2C1的分子量在非糖基化情况下为~116kDa。
为研究MAN2C1的生物学意义,本实验室用反义技术抑制MAN2C1基因在细胞中的表达,观察到:人B淋巴细胞瘤细胞株BJAB发生肿胀样死亡;人T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞间黏附增强,包括CD54和LFA-1等不少黏附分子及与黏附相关的分子的表达增强,细胞的骨架蛋白发生重排;EB病毒转化的人B细胞SKW6对抗-Fas抗体诱导的凋亡发生抵抗;人鼻咽癌细胞株CNE-2L2的恶性生物学行为(肿瘤的生长和转移)减弱,细胞间的黏附增强,细胞的E-钙黏蛋白表达增高,细胞的端粒变短。但是,要深入了解MAN2C1的生物学意义,除了进一步研究MAN2C1基因表达对多种细胞生物学行为的影响外,还必须在整体水平作研究。这包括制备转基因动物和基因敲除动物。本硕士论文工作的目的是制备转人MAN2C1基因小鼠。我构建了表达载体pIRES2-EGFP-MAN2C1,荧光检测表明它转入细胞后能表达插入的基因。为使基因整合入基因组的效率增高,把pIRES2-EGFP-MAN2C1切成线状。转染细胞的实验表明,线性化对基因的表达没有影响。转基因小鼠在北京实验动物中心制备。得到小鼠后,用基因组PCR检测MAN2C1基因整合入小鼠基因组的情况。在北京实验动物中心提供的116只小鼠中,共检测到8只阳性小鼠。经配对繁殖得到F1代小鼠。基因组PCR检测见~1/2小鼠为阳性。阳性F1代小鼠合笼在F2代有~3/4小鼠阳性。用RT-PCR检测了MAN2C1基因在转基因鼠尾部组织中的转录,在7个系的小鼠中有4个为MAN2C1mRNA阳性。为作Western印迹检测,我在原核细胞表达了MAN2C1分子的中的glyco_hydro_38结构域蛋白,用它免疫小鼠,制备了抗MAN2C1的单克隆抗体3B10。用单克隆抗体3B10作探针,取小鼠尾部组织,提取蛋白质,Western印迹检测见这4个系的小鼠为阳性。这表明,我已成功地制备了转MAN2C1基因小鼠。我对转MAN2C1基因小鼠与对照小鼠的胸腺、脾脏、骨髓及小肠作了组织学比较,未发现明显差异。我还比较了转MAN2C1基因小鼠与对照小鼠小肠上皮细胞的增殖情况,也未发现明显差异。
本论文工作还构建了pEGFP-N1-MAN2C1,用转染实验分析了MAN2C1在细胞中的定位。初步观察表明,MAN2C1定位于细胞的胞质中。另外,本论文工作还用iRNA技术抑制了小鼠MAN2C1高表达的NIH-3T3细胞中MAN2C1基因的表达,为研究小鼠MAN2C1的生物学意义打下了一点基础。