研究背景及目的急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是临床上常见的危重疾病。AKI的发生率、病死率逐年升高,在普通人群中的发生率约为0.25%,住院患者中可达18%,在重症监护病房则高达30%-60%。AKI普通人群中的死亡率约为8.8%,在危重症患者中死亡率可高达50-80%。然而,有随访研究表明,约33.6%的重度患者在出院14个月后会进展为CKD甚至是ESRD。然而,AKI进展为CKD的机制目前仍未探明。肾小管上皮细胞中线粒体数量多,代谢旺盛,对缺血、缺氧等刺激十分敏感。研究发现,肾小管上皮细胞在发生缺血再灌注的数小时内即可观察到应激性衰老的发生。因此,衰老作为缺血再灌注后细胞重要的生物学事件之一,在AKI-CKD进展中的作用受到了广泛的关注。由于衰老细胞可以分泌大量促纤维化因子、促炎因子、趋化因子、生长因子、基质和蛋白酶等衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype,SASP),加重肾组织的局部炎症反应,促进了肾间质纤维化的进展。同时,衰老细胞还通过发挥凋亡抵抗作用使其不易被巨噬细胞清除而滞留于损伤部位,以致损害效应不断加重。综上所述,缺血再灌注后肾小管上皮细胞发生应激性衰老,影响了肾组织的修复并通过释放SASP进一步加重肾组织的损伤,因而导致肾功能不断恶化,逐步进展为慢性肾脏病甚至是终末期肾脏疾病。DcR2作为肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的受体之一,具有凋亡抵抗作用。同时,DcR2也可作为细胞衰老的标志,在肿瘤细胞和衰老的成纤维细胞以及体外高糖培养的HK-2细胞中高表达。研究发现,通过干预DcR2表达,肝脏纤维化程度减轻,提示DcR2可能在纤维化进展过程中发挥重要作用。另外,DcR2作为跨膜受体,其胞外段可被蛋白酶剪切形成具有生物功能活性的可溶性分子,因此DcR2可在血清中检测到。然而,截至目前DcR2在缺血再灌注大鼠肾组织和尿液中的表达水平以及与肾组织慢性化之间的关系尚无研究报道。本实验主要包括以下三方面,首先为缺血再灌注大鼠肾组织DcR2表达及uDcR2/Cr水平与肾功能及肾组织慢性评分的相关性分析;其次,缺血再灌注大鼠肾组织中DcR2与肾间质纤维化标志物α-SMA、Collagen IV的关系;最后,缺血再灌注大鼠肾组织中DcR2与衰老标志物SA-β-gal、P16Ink4a的关系。实验方法:1.构建轻、重度I/R大鼠肾损伤模型随机选取健康雄性SD大鼠,用无损动脉夹夹闭双侧肾蒂制备大鼠缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤模型。轻度损伤(I/R45min)和重度损伤(I/R60min)模型分别夹闭45min、60min后放开双侧动脉夹给予肾脏再灌注。假手术(sham)模型,仅分离双侧肾蒂但不用动脉夹夹闭,其它操作步骤与I/R组相同。2.检测两组I/R大鼠肾功能制备I/R大鼠肾损伤模型后,分别于术后1、3、7、21、35天收集双侧肾组织,腹主动脉穿刺采集血液2ml,代谢笼收集24小时尿液。检测各组血肌酐(Serum creatinine,Scr)、尿NAG酶水平。3.两组I/R大鼠肾组织慢性化评分制备I/R大鼠肾损伤模型后,分别于术后1、3、7、21、35天收集双侧肾组织,10%福尔马林多聚甲醛室温固定,24小时后进行石蜡包埋制备蜡块。石蜡切片(厚度2μm),常规脱蜡、水化后进行PAS染色和Masson染色。使用高倍显微镜,在200倍视野下,采用双盲法,由两名医师共同观察肾组织形态学变化并按照下述方法进行肾组织慢性化评分[8,9]。随机选取肾组织皮髓交界区域10个不连续的视野,计算炎细胞浸润、肾小管萎缩、肾间质纤维化面积的比例:0分,无损伤;1分,<25%;2分,25%~50%;3分,51%~75%;4分>75。4.免疫组化检测两组I/R大鼠肾组织DcR2表达选取待检测的大鼠肾组织蜡块,石蜡切片(厚度2μm),常规脱蜡、水化后行免疫组化检测肾组织DcR2表达。在高倍显微镜,200倍视野下计数,每个肾组织随机选取10个不连续的视野。镜下观察细胞质被染成棕色即为DcR2阳性。计算DcR2阳性区域面积占总面积的比例,0分:0%~5%;1分:6%~25%;2分:26%~50%;3分:51%~75%;4分:≥76%[10]。5.ELISA检测两组I/R大鼠uDcR2/Cr水平制备I/R大鼠肾损伤模型,分别于术后1、3、7、21、35天使用代谢笼收集24小时尿液,3000 rpm/分钟离心20-30分钟,吸取上层血清。酶联免疫吸附法(ELISA)检测尿DcR2(uDcR2)水平并使用尿肌酐校正,结果以uDcR2/Cr表示。6.两组I/R大鼠肾组织DcR2表达量及uDcR2/Cr水平与肾功能及肾组织慢性化评分的相关性分析肾组织DcR2的表达及uDcR2水平与肾功能及肾组织慢性化评分的相关性使用spearman统计学分析方法。7.免疫荧光共染检测I/R60min大鼠肾组织DcR2与纤维化标志的表达关系(1)免疫荧光共染检测缺血再灌注7天后两组I/R大鼠模型肾组织DcR2与纤维化指标α-SMA和Collagen IV的共表达。激光共聚焦显微镜下观察结果并进行肾间质纤维化程度评分。使用高倍显微镜,在200倍视野下,随机选取10个不连续的区域进行计数,采用双盲法,由两名医师共同实施。计算α-SMA和Collagen IV阳性区域面积:0分,无;1分,<25%;2分,25%~50%;3分,51%~75%;4分,>75%[10]。(2)使用spearman分析I/R大鼠肾组织DcR2表达量与肾间质纤维化程度的关系。8.免疫化学染色检测I/R60min大鼠肾组织DcR2与衰老标志的表达关系(1)免疫组化和SA-β-Gal染色检测肾组织DcR2与SA-β-Gal的共表达情况。高倍显微镜下观察结果并计数呈DcR2和SA-β-Gal双阳性表达的肾小管的比例。(2)免疫荧光共染检测肾组织DcR2和P16Ink4a共表达情况。激光共聚焦显微镜下观察结果并计数呈DcR2和P16Ink4a双阳性表达的肾小管上皮细胞比例。实验结果1.两组I/R大鼠肾功能变化I/R45min及I/R60min大鼠Scr、u NAG/Cr水平显著高于Sham组。I/R45min大鼠再灌注1天后Scr水平到达峰值后逐渐下降,35天时Scr水平已降至正常(P>0.05)。I/R60min大鼠各时间点Scr水平均显著高于I/R45min,再灌注3天Scr水平到达峰值后逐渐下降,但35天时仍有80%的大鼠Scr未恢复正常。uNAG/Cr变化与Scr基本相同,I/R45min大鼠uNAG/Cr再灌注1天后逐渐恢复正常,而I/R60min大鼠再灌注35天u NAG/Cr仍高于正常水平(P<0.05)。2.两组I/R大鼠肾组织慢性化评分缺血再灌注后皮髓交界区域出现广泛的肾小管坏死、脱落等急性病理损伤表现。与Sham组(0分)相比,再灌注35天I/R45min大鼠肾组织基本恢复正常,肾组织慢性化评分为(3.67±0.58)分。I/R60min与I/R45min相比,病理损伤程度明显加重,并在35天可观察到30%以上区域出现肾小管萎缩、肾间质纤维化等慢性化表现,肾组织慢性化评分为(8.33±1.29)分。3.两组I/R大鼠肾组织DcR2表达与分布DcR2仅在肾小管上皮细胞表达,正常肾组织DcR2低表达。I/R45min大鼠再灌注1天肾组织DcR2表达量到达峰值,随后逐渐下降,再灌注35天DcR2表达量与Sham组比较差异无统计学意义(P>0.05)。I/R60min大鼠DcR2表达量明显高于I/R45min,再灌注3天到达峰值后逐渐下降,但35天时仍有大量DcR2表达,与Sham组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。DcR2高表达主要见于修复不良的区域,而DcR2低表达部位肾组织修复良好。4.两组I/R大鼠uDcR2/Cr水平Sham组uDcR2水平低下,缺血再灌注后uDcR2水平显著升高。I/R45min组大鼠再灌注后第1天uDcR2水平明显升高并到达峰值,后随再灌注时间延长uDcR2/Cr水平逐渐降低,再灌注第35天时uDcR2/Cr水平降至正常(P>0.05)。I/R60min大鼠再灌注第3天uDcR2水平到达峰值,随着再灌注时间延长uDcR2水平逐渐降低但仍明显高于Sham组(P<0.05)。5.两组I/R大鼠肾组织及尿液DcR2变化与肾功能及组织慢性化评分的相关性分析I/R45min、I/R60min大鼠肾组织DcR2表达量与Scr、uNAG/Cr及肾组织慢性化评分呈正相关,I/R45min相关系数分别为0.943、0.913、0.829(P<0.05);I/R60min相关系数分别为0.857、0.909、0.851(P<0.05)。I/R45min、I/R60min大鼠uDcR2/Cr水平与Scr、uNAG/Cr及肾组织慢性化评分呈正相关,I/R45min相关系数分别为0.943、0.943、0.886(P<0.05);I/R60min相关系数分别为0.920、0.847、0.827(P<0.05)。6.I/R60min大鼠肾组织DcR2与肾小管间质纤维化标志的关系免疫荧光共染结果示,I/R60min大鼠再灌注21、35天可见DcR2阳性肾小管及阳性区域高表达α-SMA和Collagen IV,DcR2与肾小管间质纤维化标志α-SMA和Collagen IV的表达成正相关,相关系数分别为0.885、0.806(P<0.05)。提示DcR2与缺血再灌注后肾组织慢性化有关。7.I/R60min大鼠肾组织DcR2与衰老标志的关系免疫化学染色结果示,I/R60min组大鼠肾组织SA-β-gal、P16Ink4a随着再灌注时间延长表达增加,并且85%以上的DcR2阳性肾小管高表达SA-β-gal、P16Ink4a。提示DcR2阳性的肾小管上皮细胞具有衰老表型。结论本研究证实了轻、重度缺血在灌注损伤模型中肾组织DcR2的表达与肾组织慢性化以及与肾小管细胞衰老密切相关,表明了DcR2可能在肾组织修复不良中发挥重要作用。同时,uDcR2/Cr水平在肾组织修复期明显增高,因此,uDcR2/Cr可能是评估缺血再灌注肾损伤的潜在预后因子。