论文部分内容阅读
目的:肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）是最为常见的成人发病的神经系统变性疾病之一,人群发病率不到十万分之五。ALS以选择性损害脊髓前角、脑干和大脑皮层运动神经元为特征,临床表现为进行性出现四肢肌肉的无力、萎缩、肌束震颤,并有肌张力增高、腱反射亢进、病理征阳性以及构音障碍,最终因呼吸衰竭而死亡,病人存活期为3-5年。根据其发病和遗传特点可分为家族性肌萎缩侧索硬化（Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis,FALS）和散发性肌萎缩侧索硬化（Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis,SALS）,其中FALS不足10%,而SALS则占整体ALS的90%以上。目前ALS的发病机制尚不清楚,但FALS中有大约20%是由于编码Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）的基因突变引起,其突变位点在21号染色体长臂Cu/Zn SOD基因内,即21q22.1-22.2。研究认为在家族性肌萎缩侧索硬化患者和转基因鼠中,突变SOD1发生了错误折叠,使其不能被泛素-蛋白酶体系统降解,导致在胞浆内聚集,形成SOD1阳性包涵体,而异常聚集的SOD1又具有了获得性毒性,从而影响运动神经元的功能,导致疾病的发生;神经元内的泛素阳性包涵体被公认为是肌萎缩侧索硬化的病理学标志,运动神经元中泛素化聚集物的形成与积累参与了突变SOD1毒性功能的获得。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）在降解突变蛋白的过程中起到重要作用,而底物蛋白泛素化则是UPS的启动信号。本研究旨在应用经典家族性肌萎缩侧索硬化模型SOD1G93A转基因小鼠,在底物蛋白泛素化这一水平定性研究泛素与SOD1蛋白发病过程中相互作用方式,从而揭示突变SOD1蛋白的泛素化过程能否正常进行。方法:实验动物采用经典家族性肌萎缩侧索硬化模型SOD1G93A转基因小鼠,并对其基因进行鉴定,阳性者即为SOD1G93A转基因鼠,阴性者作为同窝对照。实验分为三组:症状前期组、症状期组和终末期组,每组均设相应的同窝对照;各个时期每组取6只小鼠。实验技术采用蛋白质免疫印迹、激光共聚焦显微镜和免疫共沉淀的方法,分别观察小鼠腰膨大组织中SOD1蛋白的表达以及泛素与SOD1两种蛋白在SOD1G93A转基因小鼠症状前期、症状期、终末期及其同窝对照腰膨大组织中的分布、共定位以及相互结合情况。结果:1蛋白质免疫印迹（Western blot）检测显示:SOD1G93A转基因小鼠的腰膨大组织中有两条SOD1条带,分子量小的条带为小鼠自身携带的SOD1（21KD）,另一分子量较大的条带为转人突变SOD1（23KD）;而同窝对照组则只含有小鼠自身携带的内源性SOD1一条带。2激光共聚焦显微镜发现:对照组:可见正常形态及数量的脊髓前角运动神经元,泛素与SOD1蛋白在胞浆内广泛、均匀分布,并且二者存在广泛的共定位;症状前期:脊髓前角的运动神经元数量多,泛素与SOD1蛋白在胞浆内的含量丰富、分布均匀,并且二者亦广泛的共定位;症状期:运动神经元数量较症状前期有所减少,泛素与SOD1在胞浆内广泛共定位的背景上还可见点状聚集物,二者在聚集物中亦存在共定位的融合像;终末期:脊髓前角的运动神经元数目显著减少,细胞的基本形态消失,泛素与SOD1在脊髓前角内形成点状、片状、不规则状的聚集物,聚集物中可见二者共定位的融合像。3免疫共沉淀观察结果:在各组样品中都检测到了梯状条带,且实验组与对照组无区别,表明样品中存在泛素化的SOD1蛋白;用10%SDS-PAGE凝胶系统检测与泛素相互作用的SOD1蛋白,在17KD marker的位置可见一条清晰的条带,实验组与对照组无区别,表明样品中与泛素相结合的是小鼠的内源性SOD1。结论:SOD1G93A转基因小鼠中突变SOD1蛋白的泛素化过程发生障碍。