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前言 自70年代Folkman首先提出肿瘤生长和转移与血管依赖性的关系以来,人们对血管生成与肿瘤的关系极为重视。大量实验表明:肿瘤的持续生长必须依赖新生血管生成,新生血管可以为肿瘤提供足够的营养和氧,运走代谢废物,以利于其快速生长,并为肿瘤细胞经循环系统转移提供条件。在肿瘤血管生成的过成中,血管生成因子发挥了很大的作用。例如:血管内皮生长因子(vas cular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastic growth factor,bFGF)、转化生长因子-β、(transforming growth factor-β,TGF-β)等,其中以VEGF最为重要。它不仅促进血管内皮细胞分裂增殖,还促使血管通透性增加。在人体许多组织,特别是食管、肺、腺体、肾、肝、心肌中可检测到VEGF的表达。近年来,在多种人类肿瘤中发现了VFGF的过量表达,它可直接促进肿瘤的血管生成。因此,许多学者认为VEGF与肿瘤的侵袭、转移等生物学行为密切相关。由于VEGF在血管生成中的关键作用,以VEGF生物通道为靶点的抗肿瘤血管生成已成为目前研究的热点。 食管癌是常见的恶性肿瘤之一,严重地威胁人类的健康和生命。本实验旨在用分子生物学的方法检测和分析原发性食管癌中VEGFmRNA的表达情况,探讨其与食管癌的临床分期、淋巴结转移及预后的关系。 实验材料 1.材料:收集2000年6月-2001年10月的中国医科大学第一附属医院胸外科和辽宁省肿瘤医院胸外科共36例食管癌手术患者的癌组织和24例癌旁6cm以上的正常食管组织,手术切除后立即送至一80t深低温冰箱中冻存。所有病例术前均未发现有远处转移,未行放疗和化疗,术后均有病理证实。36个病例中男性24例,女性 12例;小于 60岁的 20例,大于等于 60岁的 16例;平均年龄 59.3岁(范围 33-78岁h均为鳞癌;TNM分期互期 14例,D期13例,皿期9例;其中18例有淋巴结转移。 2.试剂:RNA提取试剂 TRIZ。l购自 GIBCO BRL公司;TaK。R。RNA PCR Kit(AMV)2.二购自宝生物(大连)工程有限公司;RT-PCR引物由上海 Sangon生物工程公司合成;pGEM-3Zf(+)DNA/HaV皿Markers购自华美生物工程公司;其它试剂均为国产分析纯。 3.主要仪器设备:超声粉碎机*PS-l型,上海超声波仪器厂八台式高速低温高心机(DUPONT SUPER-2型,美国 Sorvall公司);紫外分光光度计(UV-260型,日本Shimadz。公司);多功能电泳仪(M*tiPhor fi型,瑞典 Ph删acia Biotech公司);BiometraUnto 11型 PCR仪(德国h凝胶自动成象及分析系统(UPV,USA人 实验方法 1.总mRNA提取:参照TRIzol说明书分别提取食管癌组织和癌旁正常食管组织的总RNA。具体步骤为:剪碎的食管癌组织和癌旁正常食管组织各 100mg用 Ind TRIzol试剂匀浆,加 200…氯仿快速震荡15 see,室温放置5 min,4℃离心120009,15 min。取上清加人 500gi 异丙醇,冰上沉淀 3h以上,4℃离心 120009,10 min,弃上清,沉淀经 lrnl 75%乙醇洗一次,4t离心 75009,5 dn,奔上清,最后用适量的无Rnase水溶解RNA沉淀,用紫外分光光度计测定ODm和OD罚。,计算RNA纯度(OD删/OD。。)和浓度(OD删X稀鹏数 X 40/1000=pg/… RNA)。 2.逆转录合成 CDNA第一链:取总 RNA Zgl用于 CDNA第一 ·2· 链合成。在体积为12pl的逆转录反应体系中含有如下试剂: MgC12 2卜1;10 X NA bllllefl·25 pl;Rll3S6 Frs6 dHZO 4.5卜1;dNTP lgl;Rnase Inhibitor 0.25 gi;Reverse Transcnptase 0.5 41;Random 9 iners 0.5…。逆转录反应条件是:30T 10 dn;50℃30ndn;99T smin;5℃smln。 3.PCR扩增:VEGFcDNA的引物,根据 VEGF基因结构,选择 能同时扩增四种同源体CDNA的碱基序列。上游引物为:5”- AAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATC-3”;下游引物为:5”- CTITTCCGCTCTGAGCAAGGC-3”;VEGFCDNA的特异引物稀ie 释终浓度为100PmoV…。取6…cg*A用于mR扩增,在体积为 22pl的反应体系中含有如下试剂:MgCI。1.5pl;10 x RNA buffer ZwRnase Free dH。O 16·sul;TaKaRa TaqTM 0.Zwl;加人上、下游 弓物各…l。VEGFcDNA的扩增条件为:95℃ Zmin;94℃ lmin;55 ℃玉dn;72℃* smin;28个循环;最后 72t延伸 7 dn。 4.PCR产物检测:取 10gi PCR产物进行 12%聚丙烯酸胺凝 胶电泳,进行摸乙锭染色(终浓度 0.spg/all八凝胶经 UPV凝胶 成像分析系统进行扫描分析。 5.统计学分析:采用 X‘检验J<0 05,差异有统计学意义。 实验结果 二.VEGFmRNA的表达与原发性食管癌:在36例癌组织中,有 28例表达 VEGF口lmRNA(77.8%);28例表?