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前言 自70年代Folkman首先提出肿瘤生长和转移与血管依赖性的关系以来，人们对血管生成与肿瘤的关系极为重视。大量实验表明：肿瘤的持续生长必须依赖新生血管生成，新生血管可以为肿瘤提供足够的营养和氧，运走代谢废物，以利于其快速生长，并为肿瘤细胞经循环系统转移提供条件。在肿瘤血管生成的过成中，血管生成因子发挥了很大的作用。例如：血管内皮生长因子(vas cular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastic growth factor，bFGF)、转化生长因子-β、(transforming growth factor-β，TGF-β)等，其中以VEGF最为重要。它不仅促进血管内皮细胞分裂增殖，还促使血管通透性增加。在人体许多组织，特别是食管、肺、腺体、肾、肝、心肌中可检测到VEGF的表达。近年来，在多种人类肿瘤中发现了VFGF的过量表达，它可直接促进肿瘤的血管生成。因此，许多学者认为VEGF与肿瘤的侵袭、转移等生物学行为密切相关。由于VEGF在血管生成中的关键作用，以VEGF生物通道为靶点的抗肿瘤血管生成已成为目前研究的热点。 食管癌是常见的恶性肿瘤之一，严重地威胁人类的健康和生命。本实验旨在用分子生物学的方法检测和分析原发性食管癌中VEGFmRNA的表达情况，探讨其与食管癌的临床分期、淋巴结转移及预后的关系。 实验材料 1．材料：收集2000年6月-2001年10月的中国医科大学第一附属医院胸外科和辽宁省肿瘤医院胸外科共36例食管癌手术患者的癌组织和24例癌旁6cm以上的正常食管组织，手术切除后立即送至一80t深低温冰箱中冻存。所有病例术前均未发现有远处转移，未行放疗和化疗，术后均有病理证实。36个病例中男性24例，女性 12例；小于 60岁的 20例，大于等于 60岁的 16例；平均年龄 59．3岁（范围 33－78岁h均为鳞癌；TNM分期互期 14例，D期13例，皿期9例；其中18例有淋巴结转移。 2．试剂：RNA提取试剂 TRIZ。l购自 GIBCO BRL公司；TaK。R。RNA PCR Kit（AMV）2．二购自宝生物（大连）工程有限公司；RT－PCR引物由上海 Sangon生物工程公司合成；pGEM－3Zf（＋）DNA／HaV皿Markers购自华美生物工程公司；其它试剂均为国产分析纯。 3．主要仪器设备：超声粉碎机＊PS－l型，上海超声波仪器厂八台式高速低温高心机（DUPONT SUPER－2型，美国 Sorvall公司）；紫外分光光度计（UV－260型，日本Shimadz。公司）；多功能电泳仪（M＊tiPhor fi型，瑞典 Ph删acia Biotech公司）；BiometraUnto 11型 PCR仪（德国h凝胶自动成象及分析系统（UPV，USA人 实验方法 1．总mRNA提取：参照TRIzol说明书分别提取食管癌组织和癌旁正常食管组织的总RNA。具体步骤为：剪碎的食管癌组织和癌旁正常食管组织各 100mg用 Ind TRIzol试剂匀浆，加 200…氯仿快速震荡15 see，室温放置5 min，4℃离心120009，15 min。取上清加人 500gi 异丙醇，冰上沉淀 3h以上，4℃离心 120009，10 min，弃上清，沉淀经 lrnl 75％乙醇洗一次，4t离心 75009，5 dn，奔上清，最后用适量的无Rnase水溶解RNA沉淀，用紫外分光光度计测定ODm和OD罚。，计算RNA纯度（OD删／OD。。）和浓度（OD删X稀鹏数 X 40／1000＝pg／… RNA）。 2．逆转录合成 CDNA第一链：取总 RNA Zgl用于 CDNA第一 ·2· 链合成。在体积为12pl的逆转录反应体系中含有如下试剂： MgC12 2卜1；10 X NA bllllefl·25 pl；Rll3S6 Frs6 dHZO 4．5卜1；dNTP lgl；Rnase Inhibitor 0．25 gi；Reverse Transcnptase 0．5 41；Random 9 iners 0．5…。逆转录反应条件是：30T 10 dn；50℃30ndn；99T smin；5℃smln。 3．PCR扩增：VEGFcDNA的引物，根据 VEGF基因结构，选择 能同时扩增四种同源体CDNA的碱基序列。上游引物为：5”－ AAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATC－3”；下游引物为：5”－ CTITTCCGCTCTGAGCAAGGC－3”；VEGFCDNA的特异引物稀ie 释终浓度为100PmoV…。取6…cg＊A用于mR扩增，在体积为 22pl的反应体系中含有如下试剂：MgCI。1．5pl；10 x RNA buffer ZwRnase Free dH。O 16·sul；TaKaRa TaqTM 0．Zwl；加人上、下游 弓物各…l。VEGFcDNA的扩增条件为：95℃ Zmin；94℃ lmin；55 ℃玉dn；72℃＊ smin；28个循环；最后 72t延伸 7 dn。 4．PCR产物检测：取 10gi PCR产物进行 12％聚丙烯酸胺凝 胶电泳，进行摸乙锭染色（终浓度 0．spg／all八凝胶经 UPV凝胶 成像分析系统进行扫描分析。 5．统计学分析：采用 X‘检验J＜0 05，差异有统计学意义。 实验结果 二．VEGFmRNA的表达与原发性食管癌：在36例癌组织中，有 28例表达 VEGF口lmRNA（77．8％）；28例表?