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目的:为进一步研究hTERT的新的生物学功能,探索肝癌基因治疗的新途径与新方法,本研究采用RNA干扰技术,以SMMC-7721细胞为研究对象,将hTERT mRNA为作用靶标,在体外细胞水平下调hTERT的表达后,观察肝癌细胞一般生物学特性的改变以及抑癌基因H2AX和甲基化转移酶hDNMT3b表达的改变。方法:利用PCR技术克隆U6启动子,构建RNAi表达空载体pGFP-U。将hTERT cDNA序列(AGACCAAGCACTTCCTCTACT,AF015950:980-1000bp)及其反向重复序列以9bp连接序列连接后再加上RNA聚合酶Ⅲ的终止序列(TTTTTT),将此段DNA序列克隆至pGFP-U载体的U6启动子下游,构建重组载体pGFP-shTERT,该目的载体可以在体内表达靶向hTERT的短发卡RNA。将重组质粒与对照质粒pGFP-U分别转染SMMC-7721细胞。转染48h后,倒置荧光显微镜下进行观察,并以G418筛选抗性转染细胞。以MTT实验测定SMMC-7721细胞的生长速度;以TRIzol试剂分别提取各组细胞总RNA,并以各组总RNA为模板进行两步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),检测分析hTERT、H2AX、DNMT3b基因的表达。结果:RNAi空载体pGFP-U和RNAi重组载体pGFP-shTERT经酶切、测序验证。在两组转染细胞中均能观察到绿色荧光蛋白的高效表达。与转染对照质粒pGFP-U的SMMC-7721细胞相比,转染表达shRNA重组质粒的细胞其hTERT基因表达水平显著下降,细胞生长速度变慢,H2AX基因表达水平显著提高,而DNMT3b没有明显改变。结论:1.成功构建RNAi空载体pGFP-U和靶向hTERT的重组载体pGFP-shTERT,并获得稳定表达靶向hTERT的shRNA的SMMC-7721肝癌细胞株。2.SMMC-7721细胞hTERT下调后,明显抑制细胞的增殖能力。同时,hTERT可与H2AX发生作用,对H2AX的表达有一定调节作用,但对DNMT3b表达无明显影响。