研究背景溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）属于非感染性、炎症性肠道疾病,以大肠炎症和溃疡为主要病理表现。北美、欧洲和大洋洲的患病率在0.3%至0.5%之间。1990年至2003年期间,中国UC的患病率约为1.16/10000。尽管中国UC的患病率远低于欧美国家,但近20年来,门诊就诊的UC人数呈上升趋势。氨基水杨酸制剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、生物制剂、白细胞吸附疗法等治疗手段虽能不同程度控制UC的炎症活动,但均存在一定的局限和不足,且常伴有并发症。中草药具有消炎、抗菌、抗病毒、调节免疫等多种作用,最近在治疗溃疡性结肠炎方面引起了关注。目前,在中国,越来越多的UC患者寻求中药疗法。本团队在传承国医大师路志正先生学术思想的基础上,基于乌梅丸、芍药汤、葛根芩连汤等治疗泄痢之证的经典方剂化裁出清热化湿调枢方,本团队已在临床上应用该方治疗UC 30余年,患者反应良好。药物组成为败酱草、黄连、乌梅、太子参、炒白术、茯苓、甘草、枳实、葛根、当归、白芍、木香,共12味药物。《伤寒论》中记载乌梅丸又主久利。经后世医家验证,发现乌梅丸在治疗UC中确有一定疗效。几项meta分析提示,乌梅丸加减联合西药治疗UC在缓解临床症状和肠镜下表现方面均优于单纯西药对照组,同时安全性更好。此外,与单纯西药治疗相比,单用乌梅丸加减治疗UC在治愈率、总有效率、复发率、不良反应率方面以及改善中医证候、肠镜下表现、疾病活动度方面均有一定优势。同时,也有大量的循证医学证据支撑芍药汤、葛根芩连汤治疗UC有效且安全。本团队在临床上运用清热化湿调枢方治疗偏湿热类型的活动期UC,效果显著,但目前.尚无研究阐述其疗效机制。本研究拟结合网络药理学首先预测清热化湿调枢方的可能作用靶点,然后在患者中进行初步验证,最后通过动物实验进一步探索其作用机制,在最大程度上保证生物学指标选择准确且合理的基础上,为清热化湿调枢方治疗UC提供更可靠的实验室证据。研究方法1.Meta分析:通过meta分析这一循证医学方法系统梳理单纯口服清热化湿类中药复方治疗大肠湿热型UC的有效性和安全性。具体方法:检索中国知网期刊数据库（CNKI）、万方医学文献服务平台、维普中文期刊网（VIP）、中国生物医学文献服务系统（CBM）、PubMed、Embase、Cochrane图书馆。纳入随机、证型为大肠湿热证,且单纯口服中药复方或西药治疗UC的临床对照试验,对纳入文献采用Cochrane风险偏倚评估工具评价质量,并使用Review Manager V.5.3软件合并各指标效应量。2.网络药理学:通过网络药理学方法预测清热化湿调枢方治疗UC的可能作用靶点。具体方法为:首先提取清热化湿调枢方全方有效成分并匹配相应药物作用靶点,然后再和疾病相关靶点进行匹配,使用Cytoscape3.9.0软件,构建“疾病-药物-有效活性成分-相交靶点”网络关系图,并进行药物-疾病相交靶点蛋白互作网络分析。通过对GO功能富集分析和KEGG传导信号通路富集分析预测相关信号通路。3.信号通路相关作用靶点验证:轻、中度UC患者服用清热化湿调枢方前,服药4周、8周时,通过ELISA法检测患者血清中NF-kB信号通路上下游相关蛋白靶点（TLR4、IL-6、IL-1 β、TNF-α、COX-2）的含量。4.动物实验:以体重、DAI、结肠长度、组织学评分反映各组小鼠结肠炎症程度;采用HE染色法观察各组小鼠结肠组织学表现;通过ELISA法检测结肠组织中 MCP-1、IL-6、IL-1 β、TNF-α、COX-2 含量及血清中 FITC-D 含量;Western blotting 检测结肠组织中的 Occludin、MUC-2、ZO-1、TLR4、MyD88、IkB α、P-IkB α、NF-kBp65、P-NF-kBp65;实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测结肠组织中的IL-6、TNF-α、IL-1 β mRNA;16SrRNA对肠道内容物菌群进行测序。研究结果1.清热化湿类中药复方治疗大肠湿热型UC有效性和安全性的Meta分析结果:Meta分析最终纳入24篇文献,有效病例1682个,合并效应量后结果如下:（1）试验组（单纯口服清热化湿类中药复方）治疗UC在总有效率、证候有效率、肠镜有效率、腹泻、腹痛、脓血便、里急后重症状有效率方面均优于对照组（单纯口服氨基水杨酸制剂）,差异有统计学意义（P＜0.01）;（2）试验组在降低主要症状积分、证候积分、肠镜评分、Mayo评分、脓血便、腹痛、里急后重积分方面均优于对照组（P＜0.05）;（3）试验组在降低内镜下黏膜水肿、充血、糜烂、溃疡评分方面均优于对照组（P＜0.05）,但在降低假性息肉积分方面并不优于对照组（P=0.45）;（4）试验组在降低Geboes病理评分方面显著优于对照组（P＜0.05）;（5）试验组的不良事件发生率明显低于对照组（OR=0.27,95%CI[0.14,0.56],P=0.0003）;（6）试验组的复发率明显低于对照组（OR=0.15,95%CI[0.06,0.36],P＜0.0001）。2.基于网络药理学预测清热化湿调枢方治疗UC的作用靶点结果:清热化湿调枢方全方有效成分146个,其中败酱草7个、黄连10个、乌梅8个、当归2个、白芍4个、木香3个、枳实17个、葛根3个、太子参2个、炒白术4个、茯苓7个、甘草79个（部分中药含有相同成分）。根据全方有效成分筛出207个药物作用靶点,检索UC疾病相关靶点4836个,构建清热化湿调枢方-UC的维恩图,发现重叠区域的作用靶点为146个。药物-疾病相交靶点蛋白互作网络分析后发现RELA（NF-kB p65）、TNF为关键靶点蛋白。通过GO-BP、GO-CC、GO-MF功能富集分析预测清热化湿调枢方治疗UC主要与免疫反应过程、细胞微观结构及细胞因子、转录因子功能直接相关。通过KEGG信号通路富集分析预测清热化湿调枢方可能通过干预NF-kB信号通路发挥治疗UC的作用。3.轻、中度UC患者服用清热化湿调枢方前及服药4周、8周时血清中NF-kB 通路相关炎性指标及疗效相关指标的变化。（1）治疗4周、8周时患者血清TLR4、IL-1 β、TNF-α、IL-6、COX-2均显著低于治疗前（P＜0.001）,同时治疗8周时患者血清IL-1 β（P＜0.001）、TNF-α（P=0.011）、IL-6（P＜0.001）、COX-2（P=）.014)、TLR4（P=0.002）明显低于治疗4周时。（2）清热化湿调枢方治疗4周时,84.6%的患者达到了临床缓解,治疗8周时临床缓解率为100%;（3）清热化湿调枢方治疗4周、8周时CAI评分显著低于治疗前（P＜0.001,P＜0.001）,且8周的CAI评分显著低于4周（P=0.036）;（4）治疗前、治疗4周、治疗8周时患者粪钙卫蛋白的结果分布有统计学差异（Z=31.358,P＜0.001）,治疗前所有患者粪钙卫蛋白均是阳性,治疗4周后有7位（53.8%）患者转为弱阳性,5位患者（38.5%）转为阴性;治疗8周时2位（15.4%）患者为极弱阳性,其余患者（84.6%）均为阴性。（5）清热化湿调枢方治疗4周、8周时IBDQ总积分显著高于治疗前（P＜0.001,P＜0.001）,且8周的IBDQ总积分显著高于4周（P=0.013）。此外,治疗4周、8周时肠道症状、全身症状、情感功能、社会功能积分均高于治疗前（P＜0.05）,同时治疗8周时的肠道症状和情感功能评分显著高于治疗4周时（P＜0.05）;（6）治疗4周、8周时肝肾功能检查均未见异常,且治疗期间所有患者均无不良事件发生。（7）治疗前、治疗4周、治疗8周UC患者CAI评分逐渐降低,其下降趋势与患者血清中IL-1 β、TNF-α、IL-6、COX-2、TLR4水平下降趋势一致。4.通过动物实验进一步验证清热化湿调枢方干预结肠炎小鼠的效应及作用机制结果:（1）小鼠一般情况:清热化湿调枢方可显著增加结肠炎小鼠体重、降低DAI、恢复结肠长度、降低组织学评分,且效果与美沙拉嗪相近。（2）肠粘膜屏障:与正常组相比,模型组小鼠结肠Occludin、MUC-2、Z0-1蛋白相对灰度值均明显降低（P＜0.001）;与模型组相比,清热化湿调枢方组和美沙拉嗪组小鼠结肠Occludin、MUC-2、Z0-1蛋白相对灰度值均显著升高（P＜0.01）;此外,与正常组相比,模型组小鼠血清FITC-D含量明显较高（P＜0.001）,与模型组相比,清热化湿调枢方组和美沙拉嗪组小鼠血清FITC-D含量明显降低（P＜0.001）。（3）LPS/TLR4/NF-kB信号通路:与正常组相比,模型组小鼠结肠组织中LPS含量及TLR4、MyD88、P-IkBα、P-NF-kB相对灰度值均显著升高（P＜0.001）,与模型组相比,清热化湿调枢方组和美沙拉嗪组小鼠结肠LPS含量及TLR4、MyD88、P-IkB α、P-NF-kB相对灰度值均显著降低（P＜0.01）。与正常组相比,模型组小鼠结肠IL-6、TNF-α、IL-1 β mRNA水平均显著升高（P＜0.001）,与模型组相比,清热化湿调枢方组和美沙拉嗪组小鼠IL-6、TNF-α、IL-1 β mRNA水平均显著降低（P＜0.01）。ELISA结果显示,与正常组相比,模型组小鼠结肠促炎细胞因子（MCP-1、IL-6、TNF-α、IL-1 β、COX-2）水平均显著升高（P＜0.001）,与模型组相比,清热化湿调枢方组和美沙拉嗪组小鼠结肠中上述促炎细胞因子水平均显著降低（P＜0.01）。（4）肠道菌群:OTU水平的PCoA分析显示,正常组、模型组和清热化湿调枢方组的肠道菌群群落结构存在显著差异。与正常组相比,模型组的Chao、ACE、Shannon和Simpson指数均显著降低（P＜0.01）,与模型组相比,清热化湿调枢方组的Chao、ACE、Shannon和Simpson指数明均显著增加（P＜0.05）。在门水平,与正常组相比,模型组厚壁菌门和放线菌门丰度显著降低（P＜0.001）,拟杆菌门和变形杆菌的丰度显著升高（P＜0.05）。与模型组相比,清热化湿调枢方组厚壁菌门、放线菌门丰度显著增加（P＜0.001）,拟杆菌门和变形杆菌的丰度显著降低（P＜0.05）。在属水平上,与正常组相比,模型组小鼠肠道乳杆菌、双歧杆菌、阿克曼菌、苏黎世杆菌丰度均显著降低（P＜0.05）,大肠杆菌、拟杆菌、梭菌的丰度明显增加（P＜0.05）。而与模型组相比,清热化湿调枢方组乳杆菌、双歧杆菌、阿克曼菌、苏黎世杆菌丰度均显著升高（P＜0.05）,大肠杆菌、拟杆菌、梭菌的丰度均明显降低（P＜0.05）。研究结论1.单纯口服清热化湿类中药复方治疗大肠湿热型UC的临床疗效和安全性均优于单纯口服氨基水杨酸制剂,且复发率低,但尚需更高等级的循证医学证据加以验证。2.通过网络药理学方法发现清热化湿调枢方治疗溃疡性结肠炎的药效学机制涉及到免疫反应、细胞凋亡、细胞因子和转录因子活性等,与肿瘤、炎症、凋亡等信号通路相关,预测清热化湿调枢方很可能通过NF-kB信号通路发挥治疗UC的作用。3.清热化湿调枢方可下调轻、中度UC患者血清中NF-kB信号通路上下游相关靶点蛋白（TLR4、IL-1 β、TNF-α、IL-6、COX-2）的表达,其变化趋势与临床疾病指数改变趋势一致。4.清热化湿调枢方可显著增加结肠炎小鼠的体重、降低DAI、恢复结肠长度、降低组织学评分,疗效与美沙拉嗪相似。其作用机制与修复肠粘膜屏障,抑制肠源性LPS/TLR4/NF-kB信号通路的激活及恢复肠道菌群平衡有关。