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重金属污染已经严重危及全球生态环境和人类健康。铬(Cr)是生物毒性极强的重金属之一,不仅直接影响作物生长发育,而且可通过水、空气和土壤循环系统进入食物链,威胁人类健康。萝卜(RaphanussatiusL.)是原产于我国的一种重要十字花科根菜类蔬菜作物,具有较高营养和药用价值。萝卜以膨大肉质直根为产品器官,肉质根是首个遭受重金属毒害的部位,探索萝卜重金属胁迫响应分子机制显得尤为重要。miRNA介导的基因调控在植物重金属胁迫响应中有着重要作用。蔬菜作物Cr胁迫下起重要调控作用的miRNAs分离鉴定工作目前尚未见报道,极大限制了从分子遗传学角度进行蔬菜Cr吸收累积特性的遗传控制;此外,重金属吸收转运关键基因Nramp家族基因部分成员已在拟南芥、水稻等模式作物上成功分离,并通过转基因手段对其生物学功能进行了验证,然而萝卜Nramp家族基因分离鉴定和功能验证工作尚未开展,萝卜Cr吸收累积分子特征与调控机制尚未阐明。鉴于此,本研究在基因组水平分离鉴定Cr胁迫下有重要调控作用的miRNAs;分离克隆到重金属胁迫响应关键基因Nramp家族4个成员,分析其在不同Cr胁迫时间、不同重金属胁迫和不同Cr浓度胁迫下的表达特性,并通过转基因手段获得转基因植株,以期为深入解析萝卜Cr吸收累积分子遗传学特征提供理论依据。取得主要研究结果如下:1.为系统分离鉴定萝卜肉质根中Cr胁迫响应miRNAs及其靶基因,构建对照组(CK)和处理组(Cr200)两个sRNA文库。通过Solexa测序技术,分离到81个已知和72个新型miRNAs,其中54个已知和16个新型miRNAs在Cr胁迫下呈现出差异表达模式。RT-qPCR分析表明,这些差异miRNAs在不同Cr胁迫处理时间(0,6,12,24,48和96 h)下呈现出差异表达模式,其中一些miRNAs可通过负向调控相应靶基因来响应Cr胁迫。大多数靶基因编码参与调控重金属相关转录过程的转录因子家族。基于对Cr胁迫响应miRNAs及其靶基因的鉴定分析,提出一个Cr胁迫响应耐受机制和调控网络模式图。通过一些铁转运蛋白的协助,Cr6+进入到植物细胞后会产生过量活性氧,在感知Cr6+之后,植物细胞可激活一些重金属胁迫响应激素和信号分子来减少活性氧造成的氧化胁迫;与此同时,Cr6+可激活一些解毒机制来增强萝卜对Cr胁迫的适应性和耐受性。此外,一些金属蛋白(如SPL、ABC、YSL和HMA蛋白)被激活参与植物Cr胁迫响应过程,将Cr6+转运出细胞或将其转运进液泡。系列研究结果表明,Cr胁迫响应靶基因的协同表达可增强萝卜对Cr胁迫的抵御或抗性水平,以此缓解Cr6+的毒害作用。2.以萝卜高代自交系’NAU-YH’为材料,分离克隆到萝卜天然抗性巨噬蛋白(Nramp)家族基因4个成员RsNramp1、RsNramp2、RsNramp4 和 RsNramp6。四个基因 cDNA 全长分别为 1,670、1,529、1,550 和 1,450 bp,ORF 长度分别为 1,602、1,489、1,533和1,410 bp,分别编码533、537、511和469个氨基酸。萝卜Nramp家族蛋白与油菜、甘蓝和白菜Nramp蛋白同源性较高。RT-PCR与RT-qPCR分析表明,4个成员在不同Cr胁迫时间、不同重金属胁迫和不同Cr浓度胁迫下呈现出差异表达模式。RsNramp1和RsNramp6基因随着Cr胁迫时间延长呈现明显上调表达,在24 h时相对表达量最高。RsNramp1和RsNramp6基因在Cd和Pb胁迫下的相对表达量显著低于Cr胁迫,RsNramp4在Cd胁迫下的相对表达量较Cr和Pb胁迫高。RsNramp1基因随着Cr浓度升高呈现上调表达,在400 mg·L-1时相对表达量最高。成功构建萝卜RsNramp1、RsNramp2、RsNramp4和RsNramp6基因过表达载体,并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得33个转基因植株,为进一步开展萝卜Nramp家族基因功能验证打下基础并提供良好技术支持,系列研究结果将为深入解析萝卜Cr胁迫响应分子遗传学机制提供理论基础。