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志贺菌属是感染性腹泻的主要病原体之一,引起菌痢。目前,菌痢的治疗主要依赖于抗生素,随着抗生素的滥用,志贺菌频繁变异,不断产生耐药株,基因的水平转移(horizontal gene transfer,HGT)是细菌获得耐药性的主要方式。研究发现成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)广泛存在于细菌和古细菌的基因组中,其由重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)构成,与cas(CRIPSPR associated)组成CRISPR/Cas系统,靶向裂解侵入的外源基因,限制HGT。目的本研究通过检测志贺菌的CRISPR/Cas系统、耐药表型及耐药基因,分析CRISPR/Cas系统与耐药的关系;并分析接合转移及诱导耐药前后CRISPR/Cas系统的变化,为深入阐明志贺菌中CRISPR/Cas系统对耐药的调控提供依据。方法复苏并鉴定实验室保存的59株志贺菌,改良Kirby-Bauer法检测耐药表型、PCR扩增耐药基因、cas,PCR扩增CRISPR并测序,CRISPR target、BLAST分析spacer与质粒的同源性;Clustal X 2.1、Bio Edit分析接合转移及诱导耐药前后志贺菌中CRISPR/Cas系统的变化。结果1.59株志贺菌对AM、CF、TE、C、SXT及NOR的耐药率分别为59.32%、27.12%、72.88%、50.85%、67.80%、16.95%,多耐药率为57.63%。8种耐药基因tem、oxa、tet A、tet B、sul1、sul2、cat及qnr A的阳性率分别为100%、59.32%、86.44%、84.75%、89.83%、76.27%、83.05%、77.97%。2.CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3的阳性率分别为79.66%、84.75%、83.05%;每株志贺菌至少含1个CRISPR,组成4种CRISPR谱型(A-D),其中A和B型含cas基因簇cas2-cas1-cas6e-cas5-cas7-cse2-cse1-cas3。3.CRISPR1、CRISPR2的spacer数目及IS与多耐药的分布差异均有统计学意义,且多耐药株CRISPR1、CRISPR2的spacer数目多为较少的2条、1条,其CRISPR/Cas系统中多存在IS。4.CRISPR1、CRISPR2与oxa、tet A之间的差异均有统计学意义,且CRISPR1、CRISPR2阴性志贺菌均携带oxa,而tet A的携带率较低;IS与oxa、sul2及cat之间的差异有统计学意义,且相应耐药基因阳性菌株的CRISPR/Cas系统中多存在IS;CRISPR1、CRISPR2的spacer数目与oxa、tet A、sul2、cat之间的差异均有统计学意义,且相应耐药基因阳性的菌株中,CRISPR1、CRISPR2的spacer多为较少的2条、1条。5.10条spacer共匹配上25个质粒。与spacer3匹配的质粒p UMNF18_Inc FV上发现耐药基因aph、aad A2、dfr A12、apr R、hph和tem,spacer3仅存在于4株志贺菌,其均携带tem。6.敏感株和接合转移多耐药志贺菌株中均检测到cas1、cas2及孤立的CRISPR3,接合转移后cas1、cas2及CRISPR3未发生改变。敏感株和诱导耐多药志贺菌株中均检测到CRISPR1、CRISPR2及cas基因簇,诱导耐药后,cse1-cas3基因两端的4个碱基发生变异。结论1.59株志贺菌的多耐药率和耐药基因携带率均较高。2.多耐药志贺菌中,CRISPR1、CRISPR2的间隔序列数目均较少,且其CRISPR/Cas系统中多存在插入序列。CRISPR1间隔序列数目较少的志贺菌携带耐药基因的个数较多。3.接合转移后,志贺菌中孤立的CRISPR3无变化。诱导耐药后,cse1-cas3基因两端的4个碱基发生变异。