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目的:应用慢病毒转染技术下调p53缺失型白血病细胞HL-60中核干细胞因子(Nucleostemin,NS)的表达,采用Real-time PCR检测PI3K/AKT/mTOR通路中相关基因的变化情况,研究NS与PI3K/AKT/mTOR通路之间的相关性;查阅文献发现Ras/Raf/Mek/Erk通路及一些生长因子类与PI3K/AKT/mTOR通路的激活密切相关,通过对Ras/Raf/Mek/Erk通路及一些生长因子类基因的变化进行检测,初步探索NS下调后导致PI3K/AKT/mTOR变化的可能原因,为完善NS非依赖p53通路的作用机制提供依据。方法:(1)以p53野生型K562细胞和p53突变型NB4细胞为对照,普通PCR法检测p53基因在HL-60细胞中的表达情况。(2)将慢病毒表达载体NS-siRNA-GV248与其两种辅助包装原件载体质粒共同转染至293T细胞内进行病毒的包装及滴度测定。(3)根据HL-60细胞的MOI值及病毒滴度,将慢病毒转染至HL-60细胞中以下调NS的表达,倒置荧光显微镜观察转染效率,Real-time PCR和Westernblot检测NS在基因和蛋白水平上的敲减情况。(4)Real-time PCR检测HL-60细胞中NS表达下调前后PI3K/AKT/mTOR和Ras/Raf/Mek/Erk通路中的相关基因,以及GrB2、STAT5、NFκB、TGFβ基因的表达情况(5)采用SPSS15.0统计软件对数据结果进行处理,数据以均值±标准差(x±s)表示。多组样本间的比较采用单因素方差分析,进一步的两两比较采用Bonferroni法,校正检验水平α’=0.0167;两组样本间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)普通PCR结果显示,K562和NB4细胞中有p53表达,而HL-60细胞中不表达p53。(2)针对NS基因下调的慢病毒表达载体NS-RNAi-GV248转染至293T细胞内进行包装、浓缩,检测病毒滴度为2×108TU/ml。(3)倒置荧光显微镜观察转染效率达80%以上;Real-time PCR检测阴性对照组与实验组之间NS基因mRNA抑制率为56.5%;Western blot检测结果显示:无论是处于低MOI值还是高MOI值,NS蛋白表达量均出现明显下调。(4)Real-time PCR结果显示:NS表达下调后PI3K/AKT/mTOR和Ras/Raf/Mek/Erk通路中的相关基因,以及GrB2、STAT5、NFκB、TGFβ的mRNA表达量均减低,与空白对照组比较有统计学意义。结论:(1)PI3K/AKT/mTOR通路和Ras/Raf/MekErk通路相关基因,以及GrB2、STAT5、NFκB及TGF基因的表达与NS基因表达下调呈正相关。(2)NS非依赖p53作用过程可能与PI3K/AKT/mTOR通路、Ras/Raf/MekErk通路及GrB2、STAT5、TGFβ及NFκB基因有关。