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目标：经典的观点认为缩宫素(oxytocin,OT)是下丘脑垂体分泌的九肽激素,其主要生理作用是促进子宫平滑肌收缩并调节泌乳反射。近年来,越来越多的研究发现OT具有调节消化道运动和分泌的功能,可能是一种新的胃肠神经肽。我们最新的研究发现OT可通过肠神经丛抑制大鼠十二指肠纵行肌的自发收缩,但其机制尚不清楚。肌间神经元根据电生理特性可分为AH和S神经元两种类型,AH神经元为内在感觉神经元(intrinsic primary afferent neurons,IPANs),而S神经元为中间和运动神经元。在预实验中,我们发现OT可使全部的AH神经元(25/25)和部分S神经元(10/30)膜电位发生超极化,因此我们推测OT抑制十二指肠的运动可能与其调节AH神经元的活动有关。本课题的主要目的是研究OT对AH神经元电生理特性的影响及其机制。方法：将大鼠颈部脱臼处死,快速取出约1cm长的一段十二指肠,沿肠系膜剖开,粘膜面向上展开固定在盛有柯氏液的硅胶盘中。在解剖镜下用显微器械将粘膜、粘膜下层和环形肌依次剥离,剩余部分即为纵行肌-肌间神经丛标本(longitudinal muscle myenteric plexus,LMMP).将LMMP标本置于含10mg/ml木瓜蛋白酶的柯氏液中37℃消化50min,将组织剪碎后再置于含1mg/ml胶原酶II的DMEM培养基中37℃消化55min,用玻璃吸管吹打约30次,1000r/min离心6min,弃去上清,用1m1含10%胎牛血清的DMEM将沉淀悬浮,37℃培养,16h-24h后通过膜片钳全细胞记录模式分析OT对其膜电位和细胞膜上离子通道的影响；通过钙成像方法监测加入OT前后肌间神经元胞浆中Ca2+浓度的改变；通过ELISA的实验方法检测LMMP标本中IP3含量及OT释放量；通过免疫荧光双标观察OT受体(OTR)、BK通道α亚基、胞浆中OT及IPANs的标记物calbindin28K在神经元上的表达情况。实验结果：1、OT对AH神经元膜电位的影响AH神经元的静息电位为-54mV±1mV (n=30),连续给药15s后,浓度在10-7M-10-5M的OT均使膜电位发生超极化,幅度分别为4.4mV±0.5mV(P<0.05,n=9：OT10-7M),12.7mV±0.7mV(P＜0.05,n=8：OT10-6M)和8.9mV±0.8mV(P<0.05,n=8;OT10-5M)。将AH神经元用OTR阻断剂atosiban(10-6M)孵育1min之后再给予OT,原本OT诱发的超极化反应基本消失。2、OT对AH神经元动作电位参数的影响连续给予OT(10-6M)60s之后,AH神经元的1/2动作电位时程(action potential half width, AP1/2)由3.2ms±0.4ms降至2.9ms±0.3ms(P=0.04, n=12),阈刺激(threshold)由69mV±10mV增至130mV±21mV(P=0.02,n=12),去极化速率(action potential maximal depolarization, APdv/dt)及动作电位幅度(action potential amplitude, APamp)均不发生改变。3、OT对AH神经元外向离子流的影响在膜片钳电压钳模式下,设置一个100ms的step,将钳制电位从-80mV升至+50mV,观察激发出的外向离子流。连续给药60s后,三种浓度的OT均使这种外向离子流增加,增加的幅度分别为552pA±72pA(P<0.05,n=8;OT10-7M),1035pA±122pA(P<0.05,n=8：OT10-6M)和1116pA±100pA(P<0.05,n=8：OT10-5M)。若将细胞先用BK通道(large conductance calcium-activated potassium channels)的阻断剂IbTX孵育1min再加入OT,原本OT引起的外向离子流增加的现象基本消失。但IK通道(intermediate conductance calcium-activated potassium channels)的阻断剂clotrimazole和SK通道(small conductance calcium-activated potassium channels)的阻断剂apamln均无此作用。为确定BK通道是否在AH神经元上有功能性表达,进一步观察BK通道的激动剂NS1619对外向离子流的影响,发现当膜电位牵制在+50mV时,NS1619可使其增大748pA±141pA(P=0.002, n=8),该作用可完全被IbTX阻断。4、OT对肌间神经元中钙离子浓度的影响OT可使12/30肌间神经元胞浆中钙离子浓度([Ca2+]i)升高。连续给药50s后,[Ca2+]；升高到最大值,且分别在l00s(10-7M),150s(10-6M)和250s(10-5M)恢复到初始水平。三种浓度的OT作用50s分别使胞浆中钙离子的相对浓度由基准值1升高至1.3±0.2(P<0.05,10-7M；n=8),1.3±0.2(P<0.05,10-6M；n=11)和1.6±0.3(P<0.05,10-5M；n=11)。为进一步确定胞内增加的Ca2+的来源,我们将AH神经元分别用钙库清空剂thapsigargin(10-6M)和细胞膜上非特异性的钙离子通道阻断剂CdCl2(5×10-5M)孵育10min,再加入OT,外向离子流的增加值分别由678pA±78pA降至182pA±34pA(P<0.001,n=8;DMSO+OT vs.thapsigargin+OT),由1042pA±96pA降至440pA±94pA(P<0.001,n=10;vehicle+OT vs. CdCl2+0T).5、OT致AH神经元BK通道开放的信号通路将AH神经元分别用IP。受体的阻断剂2-APB(10-4M)和PLC的阻断剂U73122(10-5M)孵育10min,均可部分逆转OT引起外向离子流增加。LMMP标本在含OT(10-6M)的浴液中孵育1min,其中的IP3含量由16.0ng-ml±1.1ng/ml增加至22.0ng/ml±1.4ng/ml(P=0.001,n=16)。用atosiban(10-6M)预处理之后再加入OT,IP3含量为16.8ng/ml±0.7ng/ml(P=0.003,n=16;OT vs. atosiban+OT)6.Atosiban和KCl对LMMP标本OT分泌量的影响将LMMP标本(20μ g/300μ1)在柯氏液中孵育3min,OT分泌量为33.2ng/ml±2.6ng/ml(n=7),向柯氏液中加入atosiban(10-6M)或KCl (2×10-6M)OT分泌量分别增至47.1ng/ml±3.5ng/ml(P=0.01,b=7:atosiban treatment vs. control)和45.4ng/ml±2.5ng/ml((P=0.02,n=7:KCl treatment vs. control)。同时向柯氏液中加入atosiban和KCl,OT分泌量增至62.6ng/ml±5.0ng/ml(P=0.002,n=7,KCl+atosiban vs.KCl;P0.005,n=7,KCl+atosiban vs. atosiban).7、OTR和BK通道在LMMP标本上的定位OTR在部分肌间神经元细胞膜上表达,其中63/71阳性表达细胞呈圆形或椭圆形,近似于Dogiel type Ⅱ/AH神经元的形状。BK通道α亚基与OTR阳性表达细胞完全重合。8、OT和calbindin28K在LMMP上的表达OT和AH神经元的标记物calbindin28K均在部分LMMP的神经元上表达。统计发现,73.1%(122/167)的OT阳性细胞上有calbindin28K表达,而82.4%(122/148)的AH神经元上有OT表达。结论：OT作用于大鼠肌间神经丛AH神经元上的OT受体,激活细胞中的OTR-PLC-IP3-Ca2+信号通路,使细胞膜上的BK通道开放,K+外流引起膜电位发生超极化；OT可能是肠神经系统中一种起负反馈调节作用的自分泌神经肽。