基于蛋白质组学研究艾纳香油对VECs炎性反应的影响

来源 :贵州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Kimyueyue
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艾纳香油Blumea balsamifera(L.)DC Oil(BB Oil)作为贵州省的一种重要民族用药艾纳香的提取物,前期研究证实其具有很好的抗炎活性,并发现其中的trans-Caryophyllene和(-)-Linalool具有抗炎作用,可通过TLR4/NF-κB、花生四烯酸(AA)、Nrf2/HO-1炎症信号通路发挥抗炎作用,而其是否还存在其他的作用靶点,以及这些靶点在血管内皮细胞炎性反应中的影响尚不清楚。为了筛选和明确LPS刺激鸡血管内皮细胞炎性反应中的作用靶点,同时探明BB Oil及其活性成分对其的影响。本文首先采用PCR法和细胞免疫荧光染色法鉴定细胞物种来源和细胞类型,以此为实验前提条件,利用qPCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)等炎症细胞因子的mRNA表达水平,建立LPS刺激鸡血管内皮细胞炎性反应模型;其次采用蛋白质组学研究技术筛选LPS刺激鸡血管内皮细胞炎性反应模型的差异蛋白,GO和KEGG分析确定与炎症免疫相关的差异蛋白,并采用qPCR法和Western blot法验证蛋白质组学研究结果;再采用si RNA技术和过表达质粒转染THBS1,qPCR法检测THBS1沉默和过表达后,对细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1的mRNA表达水平的影响;最后采用MTT法检测BB Oil和trans-Caryophyllene的细胞毒性,qPCR法和Western blot法检测BB Oil和trans-Caryophyllene对THBS1、FOXO1、ACSL1、ACSL4、TIMP3的mRNA和THBS1、FOXO1、ACSL1的蛋白表达水平的影响。结果表明:1.以鸡的线粒体DNA设计的物种特异性引物对购买的细胞株DNA与鸡血液DNA模板进行PCR扩增,均能扩增出相同分子质量大小的特异的条带,同时细胞能表达血管内皮细胞的标志性抗原CD34;5μg/m L的LPS作用12 h能极显著促进鸡血管内皮细胞中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表达(P<0.01)。2.蛋白质组学研究结果显示,LPS刺激组与空白对照组细胞之间共有10个差异表达的蛋白,其中包括7个上调和3个下调的蛋白;GO和KEGG分析结果显示,THBS1、FOXO1、ACSL1、ACSL4、TIMP3这5个蛋白可能与炎症免疫相关,蛋白表达水平和或mRNA表达水平与蛋白质组学研究结果一致。3.THBS1沉默后能显著或极显著抑制LPS介导的TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1mRNA的表达(P<0.05,P<0.01);相反,THBS1过表达后能显著或极显著促进TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1 mRNA的表达(P<0.05,P<0.01)。4.0-80μg/m L浓度范围内的BB oil和trans-Caryophyllene无细胞毒性,20-80μg/m L浓度的BB oil或trans-Caryophyllene均能显著或极显著抑制LPS介导的THBS1、ACSL1、ACSL4、TIMP3的mRNA表达和THBS1、ACSL1的蛋白表达(P<0.05,P<0.01),但不能使LPS导致下调的FOXO1的mRNA和蛋白表达回升(P>0.05)。结果提示:THBS1、FOXO1、ACSL1、ACSL4、TIMP3等蛋白与鸡血管内皮细胞的炎性反应有关,且能通过抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1的mRNA表达在炎症中起作用;一定浓度的BB oil和trans-Caryophyllene能通过抑制LPS介导的THBS1、ACSL1、ACSL4、TIMP3的表达起到抗炎作用,但不能通过影响FOXO1的变化发挥作用。本研究结果将为LPS诱导的鸡血管内皮细胞炎性反应提供抗炎新靶点,同时为BB Oil治疗鸡炎症方面的研究提供新思路,为BB Oil多方面抗炎及合理开发利用打下坚实的科学依据。
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