T细胞的有效活化需要双信号,其中共刺激分子在免疫调节中发挥着重要的作用,B7-H3是共刺激分子B7家族成员之一。人B7-H3有两种不同形式的剪切体:2IgB7-H3和4IgB7-H3。2IgB7-H3胞外段由IgV-IgC两个免疫球蛋白结构域组成,而4IgB7-H3胞外段由IgV1-IgC1-IgV2-IgC2四个免疫球蛋白结构域组成。研究报道发现4IgB7-H3是人各组织细胞中B7-H3的主要表达形式,目前仍缺乏对两种剪切体的差异研究。许多共刺激分子分别以细胞膜型和可溶型两种形式存在。本实验室在健康人外周血和组织液中发现存在天然形式的sB7-H3,且发现sB7-H3仅源于2IgB7-H3。基因序列研究发现4IgB7-H3胞外段4个结构域是由编码2IgB7-H3 IgV和IgC外显子复制的结果,2IgB7-H3和4IgB7-H3两种剪切体的同源性超过95%,本研究通过氨基酸序列比对和分析,发现在人4IgB7-H3分子第一个C样免疫球蛋白结构域碳端末端存在一段独特的氨基酸序列为“PQRSPT”,其在2IgB7-H3分子序列中缺失。本研究以此为出发点获得了增加“PQRSPT”基序的2IgB7-H3-Add基因和缺失“PQRSPT”基序的4IgB7-H3-Del基因,并构建相应的基因转染细胞株,以此来探讨“PQRSPT”基序在人B7-H3基因生物学功能及可溶性B7-H3产生过程中的分子机制。一、2IgB7-H3-Add与4IgB7-H3-Del基因转染细胞株的建立RT-PCR法分别扩增2IgB7-H3与4IgB7-H3编码区全长基因,并通过拼接PCR的方法获得增加“PQRSPT”基序的2IgB7-H3-Add基因和缺失“PQRSPT”基序的4IgB7-H3-Del基因。将两个目的基因片段双酶切后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组子pIRES2-EGFP/2IgB7-H3-Add和pIRES2-EGFP/4IgB7-H3- Del,经测序鉴定正确后通过脂质体转染法将两个重组载体分别导入小鼠L929细胞。RT-PCR结果表明表明导入的外源性2IgB7-H3-Add和4IgB7-H3-Del基因已分别成功整合到L929细胞基因组中并能成功地进行转录;通过流式细胞术检测发现GFP和B7-H3蛋白在两株细胞表面均稳定高表达;Western Blot分析结果显示L929/2IgB7-H3-Add和L929/4IgB7-H3-Del细胞均能成功表达B7-H3蛋白。二、“PQRSPT”基序在人B7-H3基因生物学功能中的分子机制研究收集上述基因转染细胞的培养上清进行ELISA和Western Blot分析,结果显示在2IgB7-H3和4IgB7-H3-Del基因转染细胞培养上清中存在可溶性B7-H3蛋白,而4IgB7-H3和2IgB7-H3-Add基因转染细胞培养上清与对照组一样,都未检测出可溶性形式的存在。该研究结果表明保守性氨基酸“PQRSPT”可能是人4IgB7-H3不能形成可溶性形式的一个重要基序。同时,基因转染细胞与外周血T细胞共培养的淋巴细胞增殖实验及分泌细胞因子的检测实验结果发现,2IgB7-H3基因转染细胞能显著地促进T细胞体外增殖与细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,相比之下,增加“PQRSPT”基序的2IgB7-H3-Add基因转染细胞则无此效应;4IgB7-H3基因转染细胞能显著抑制T细胞的增殖与细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,而缺失“PQRSPT”基序的4IgB7-H3-Del基因转染细胞则无明显作用。以上研究结果均证实“PQRSPT”基序可能是4IgB7-H3分子中的功能结构域,且对B7-H3生物学功能的改变具有重要作用。综上所述,本实验成功构建了L929/2IgB7-H3-Add和L929/ 4IgB7-H3-Del两株转基因细胞,对基因转染细胞株培养上清中sB7-H3的检测结果表明了“PQRSPT”基序与人4IgB7-H3分子不能分泌可溶性形式密切相关。T细胞体外增殖实验显示,两株基因转染细胞均对T细胞的增殖和细胞因子的分泌无效应,表明“PQRSPT”基序可能是4IgB7-H3分子发挥抑制作用的重要基序。上述结果为进一步阐明sB7-H3的来源机制提供新的思路,以及为研究人B7-H3两种剪切体的差别性奠定了分子基础。