论文部分内容阅读
中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO）已是应用最为广泛的生物技术药物生产细胞,构建稳定表达治疗性生物制品的CHO工程细胞系一直是研究工作的热点。课题组前期组合应用慢病毒示踪报告基因及染色体步移技术,在CHO-K1基因组内发现6个可持续表达报告基因的位点。本研究对其中一个位点进行了表达稳定性的验证工作,并分别实现了绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）基因和人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）基因在该位点的定点整合和稳定表达。一、以整合了Zs Green1报告基因的CHO-K1-ZsGreen1-2C6细胞为研究材料,组合使用倒置荧光显微镜和流式细胞术,定量分析了ZsGreen1报告基因的表达情况。按照主细胞库到2000 L细胞生产罐放大培养的细胞代次需求,连续传代培养50代次,发现100%的CHO-K1-Zs Green1-2C6贴壁和悬浮细胞均可稳定表达ZsGreen1报告基因,提示CHO-K1细胞LOC103162981基因NW＿003626341.1内第1689碱基（上下游1614～1763碱基范围内）可作为整合位点用于外源基因的稳定表达。二、基于CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源定向修复途径,设计了含有嘌呤霉素和荧光蛋白双重筛选标签的供体片段。以CHO-K1细胞及凋亡相关基因BAK和BAX双敲除的突变株BAK-/BAX--CHO-K1为出发细胞株,在细胞基因组NW＿003626341.1内第1642碱基处分别定点敲入EGFP报告基因和HSA基因,经PCR扩增验证,共获得9株CHO-K1-EGFP单克隆细胞,11株BAK-/BAX--CHO-K1-EGFP单克隆细胞,5株CHO-K1-HSA单克隆细胞和4株BAK-/BAX--CHO-K1-HSA单克隆细胞。统计分析提示,准确敲入EGFP基因的单克隆细胞占比19%～23%,敲入HSA基因的占比8.5%～12%。三、悬浮驯化定点敲入目的基因的贴壁细胞,流式细胞术分别观察CHO-K1-EGFP和BAK-/BAX--CHO-K1-EGFP细胞内EGFP基因的表达情况,发现在连续悬浮传代培养50代次的过程中,100%的EGFP报告基因敲入细胞可以稳定表达EGFP蛋白,且单位荧光强度不低于初始细胞,验证了该整合位点表达外源基因的稳定性。批次培养HSA基因敲入细胞,与出发细胞株比较,所有敲入细胞株的生长状态均与其出发细胞株基本同步变化。获得2株蛋白表达量较高的CHO-K1-HSA细胞:CHO-K1-HSA-7和CHO-K1-HSA-50细胞,经批次培养8天蛋白积累量分别为228.50 mg×L-1和219.25 mg×L-1;获得1株蛋白表达量较高的BAK-/BAX--CHO-K1-HSA细胞:BAK-/BAX--CHO-K1-HSA-9细胞,在批次培养第9天蛋白积累量达97.24 mg×L-1。经稳定性验证和表达水平分析,确定LOC103162981基因NW＿003626341.1内第1642碱基处,可作为整合位点成为研究人员构建稳定表达治疗性蛋白质的CHO工程细胞株的可靠选择。