研究背景以免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors,ICIs）为代表的肿瘤免疫治疗已成为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的标准治疗方法之一,但免疫治疗对表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）基因突变阳性NSCLC患者疗效较差,机制尚不明确。肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）是NSCLC中最主要的病理类型,EGFR突变在LUAD发生率最高。为了深入理解EGFR基因突变对LUAD肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）的影响,及该类型患者接受免疫检查点抑制剂治疗疗效差的内在机制,我们开展了本项研究,探索不同EGFR基因状态下肺腺癌肿瘤微环境特征及与免疫治疗疗效的相关性。研究方法第一部分:采用单细胞转录组测序（Single cell RNA sequencing,sc-RNA seq）的方法从转录组层面分析EGFR突变型和EGFR野生型LUAD的免疫微环境特征。1、收集9例未经药物治疗的手术切除的肺腺癌样本进行sc-RNA seq,其中5例为EGFR阳性,4例为EGFR阴性,对不同EGFR突变状态的样本肿瘤微环境中细胞成分及各细胞亚群之间的相互作用进行分析,对比不同EGFR基因突变状态的LUAD肿瘤微环境特征。2、采用生物信息学方法,将9例未经治疗样本的单细胞测序数据与之前公开报道的对免疫治疗具有不同应答反应的3例样本单细胞测序数据进行整合分析,探索EGFR突变型LUAD肿瘤微环境中可能影响免疫应答的因素。第二部分:收集与单细胞测序样本配对的肿瘤组织石蜡切片,采用多重免疫组织化学染色（Multiplex fluorescent immunohistochemistry,mIHC）的方法,基于前期在单细胞测序中的分析结果,选择CD3、CD4、CD8、CD103、CXCL13、CD11C,CD1C和CD68抗体及多个免疫检查点蛋白抗体,从细胞成分、蛋白表达及空间位置等方面,对单细胞测序结果进行验证及进一步分析。研究结果第一部分:1.单细胞测序数据对比分析发现,未经治疗的EGFR突变恶性上皮细胞与免疫治疗后无应答者的上皮细胞具有相似的分子特征,EGFR突变型LUAD肿瘤微环境中缺乏CD8+组织驻留记忆细胞（Tissue-resident memory T cell,TRM）,该类细胞可能通过分泌CXCL13促进三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures,TLS）生成,进而提高肿瘤对免疫治疗的应答率。2.LUAD肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophage,TAM）和癌症相关成纤维细胞（Cancer associated fibroblasts,CAF）的特殊亚型也能够协助CD8+TRMs的招募、保留和增殖,而EGFR突变型LUAD肿瘤微环境中同样缺乏这一类细胞。3.与EGFR野生型LUAD相比,EGFR突变型LUAD肿瘤微环境中的T细胞通过程序性细胞死亡1/程序性死亡配体1（Programmed death1,PD-1/Programmed death-ligand 1,PD-L1）或其他免疫检查点和其他细胞类型之间的相互作用显著较少,解释了该类型患者对PD-1/PD-L1单药治疗的反应较差。第二部分:1.多重荧光免疫组化分析验证了 EGFR野生型LUAD中存在较高比例的CD8+TRMs,同时EGFR野生型LUAD的CD8+T细胞高表达CXCL13,肿瘤间质区域有大量TLS形成。2.除TIGIT在EGFR突变型肺腺癌肿瘤组织高表达外,其他免疫检查点包括PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG-3、TIM-3和CD47均表达较低,可能是该类型肿瘤对PD-1/PD-L1治疗反应较差的直接原因。研究结论本研究从单细胞水平上阐述了 EGFR突变型肺腺癌肿瘤免疫微环境的细胞组分、细胞功能及细胞相互作用,EGFR基因突变可能从转录组层面及蛋白层面调控基因表达,使具有EGFR突变的LUAD形成免疫抑制性肿瘤微环境,并导致该类型肿瘤对免疫治疗应答较差。除PD-1/PD-L1外,其他的免疫检查点抑制剂可能也对该类型肿瘤无效。针对该类型患者的治疗后续应聚焦在改善抑制型免疫微环境,采用联合治疗的方法来制定EGFR突变型肺腺癌患者的治疗策略。