芋螺（Conus）属腹足纲软体动物,全球约500多种。芋螺毒素（Conotoxin, Conopeptide, CTX）是从芋螺中得到的一类具有生物活性的多肽毒素。最近研究表明,每种芋螺可能含有1000-1900种芋螺毒素,即全世界大约有>500000种芋螺毒素,大大超过了以前认为有约5万种芋螺毒素的认识。芋螺毒素通常是由8-40个氨基酸残基组成,富含二硫键,化学结构新颖,生物活性强,作用靶位的选择性高,目前发现的芋螺毒素超家族主要有A-, T-, O-, M-, P-, I-和S-超家族等。它们已在神经科学研究领域和新药研制方面受到了前所未有的广泛关注,因此对芋螺毒素进行深入研究很有意义。由于天然芋螺毒素含量甚微,有关芋螺毒素的研发大多转向人工化学合成,但其毒性大、产率小、纯度低、成本很高,尤其是对于分子量较大的多肽,合成更为困难,合成的线性肽还要经过氧化折叠等繁琐的步骤才能获得具有二硫键配对正确的生物活性肽。因此,大量芋螺毒素药物宝库的开发仅靠化学合成还不能满足作为药物研究和商业化生产的要求。已知芋螺毒素在体内是由其前体基因经表达和翻译后修饰而获得的直接产物,因而通过基因体外重组表达,进行生物法合成是大量获得目的毒素肽的有效新途径。本研究探索用生物法合成2个芋螺毒素Ma6A和MaI126,以期低成本大量获得这2个毒素肽。芋螺毒素Ma6A和MaI126的基因均来自于大理石芋螺（Conus marmoreus）,其中Ma6A是O-超家族基因,MaIl26是一种新型T超家族芋螺毒素基因。Ma6A成熟肽含有31个氨基酸,三对二硫键,具有阻断钠离子通道的生物活性；MaIl26含有13个氨基酸,两对二硫键。我们选用毕赤酵母真核生物表达系统来重组生产芋螺毒素Ma6A和MaI126,期望通过毕赤酵母细胞内的翻译后修饰系统对外源芋螺毒素Ma6A和MaI126基因进行分泌表达,所得的重组芋螺毒素在酵母细胞分泌表达过程中完成氧化折叠,直接将具有天然芋螺毒素构象的重组多肽分泌到培养基中,通过进一步分离纯化,即可大量获得目的芋螺毒素肽。本研究通过设计Ma6A成熟肽的基因序列,利用酵母信号肽,与毕赤酵母表达载体pPICZαA相连,构建了分别含有纯化蛋白标签和不含纯化蛋白标签的表达载体pPICZαA-Ma6Af与pPICZαA-Ma6An。实验室已构建好的、含有MaI126基因的酵母表达载体pPICZA-MaI126,利用了芋螺毒素MaI126基因本身的信号肽。将上述构建好的各种表达载体进行线性化,并优化电转化条件,将3种表达载体分别转入毕赤酵母宿主菌中,经Zeocin抗生素筛选和PCR产物回收连接T-载体后,进行测序鉴定,选取含有完整目的基因、且拷贝数高的重组子,利用甲醇进行了诱导表达。在诱导过程中,探索和优化了诱导表达条件、以及载体与宿主菌之间的相互匹配。结果表明,最佳诱导时间为72h,最佳诱导培养基选择MM；通过比较3种不同酵母宿主菌（GS115、KM71、X-33）的诱导表达效果可知,芋螺毒素在宿主菌X-33中诱导表达效果较好,表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,在6kD左右和3.5kD左右出现了明显的Ma6A目的蛋白带,而1.4kD的MaIl26目的蛋白也通过反相疏水层析（RP-HPLC）初步得到分离；Ma6A基因与MaI126已成功在毕赤酵母中获得表达,重组多肽有待下一步分离纯化。本研究为利用生物法合成芋螺毒素提供了技术流程,可为后续的新药研发和临床上大量使用提供物质基础。