桃流胶病是南方桃树最严重的病害之一,给桃产业造成了巨大的经济损失。可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是桃流胶病的主要病原菌之一。然而,目前L.theobromae引起桃流胶病的致病机理尚不完全清楚。活性氧（ROS）在植物和病原菌互作中扮演关键角色,但是ROS产生和消除系统的变化规律及ROS在桃流胶病发病过程中的具体作用尚不清晰。此外,病原菌入侵时,寄主植物通常会产生大量的ROS,从而伤害病原菌,病原菌为了减少或避免这种氧化胁迫,进化出了一套抗氧化系统。其中,b ZIP转录因子AP1（Activating protein 1）是病原真菌响应氧化胁迫主要的信号感受器,并且可以调控多个抗氧化基因清除ROS。在多个病原真菌中,AP1参与ROS清除对病原菌的致病力具有重要影响。因此,探究病原真菌L.theobromae中AP1（Lt AP1）介导的ROS消除机制,对于深入了解病原菌L.theobromae在桃流胶病中的致病机理具有重要意义。本文通过生理生化、ROS代谢以及基因表达等分析,阐明ROS在L.theobromae引起的桃流胶病发病过程中的作用。最后利用遗传转化和生物化学手段,进一步揭示病原真菌L.theobromae b ZIP转录因子Lt AP1及其下游基因的功能,以期为桃流胶病的有效防控提供新思路。本文主要研究结果如下:1. 病原菌L.theobromae的侵染引起了ROS的爆发并激活植物抗氧化酶系统。随着病情的发展,植物的抗氧化能力不断削弱,导致ROS的积累以及丙二醛的产生。病原真菌L.theobromae ROS合成相关基因的表达量降低,而氧化胁迫响应和抗氧化相关基因的表达量显著上升。此外,植物激素合成相关基因和PR蛋白编码基因在接种病原菌L.theobromae的桃枝条中的表达量均明显高于对照组。综上所述,ROS的产生和积累可能在L.theobromae引发的桃流胶病发病过程中具有重要作用。2. 本研究揭示了1个来自病原真菌L.theobromae的b ZIP转录因子Lt AP1在桃流胶病发病过程中的功能。该转录因子和酿酒酵母中参与氧化胁迫响应的YAP1同源。氧化剂过氧化氢（H₂O₂）和叔丁基过氧化氢（t-BHP）均可显著诱导Lt AP1基因表达。Lt AP1基因的敲除（ΔLt AP1）会导致菌丝生长速率降低。相对于野生型菌株,ΔLt AP1突变体对多种氧化剂和硝化胁迫试剂敏感性显著增加;而对细胞壁损伤胁迫和高渗透压胁迫表现出更强的耐受性。在ΔLt AP1突变体中,谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统相关基因的表达量均显著低于野生型菌株,特别是在H₂O₂胁迫下或在侵染枝条期间。ΔLt AP1突变体对桃枝条的侵染能力显著减弱。在接种ΔLt AP1突变体的桃枝条中,ROS含量和植物抗性相关基因的表达量均显著高于野生型菌株接种的枝条。综上所述,转录因子Lt AP1可有效参与氧化胁迫应答,调控抗氧化基因表达从而影响病原菌致病性。3. 本研究鉴定了1个在ΔLt AP1突变体中下调表达,且参与氧化还原平衡的谷胱甘肽过氧化物酶编码基因Lt GPX3。该基因含有1个内含子,其编码的蛋白由167个氨基酸组成。野生型菌株中Lt GPX3基因在氧化剂（过氧化氢、叔丁基过氧化氢和过氧化氢异丙苯）胁迫下大量诱导。病原真菌L.theobromae敲除Lt GPX3基因后,ΔLt GPX3突变体对外源氧化剂（过氧化氢、叔丁基过氧化氢和过氧化氢异丙苯）和硝化胁迫试剂（亚硝基铁氰化钠）比野生型菌株更为敏感。ΔLt GPX3突变体对外源高盐胁迫敏感性提高;然而,对高渗透压胁迫以及细胞壁损伤胁迫表现出更高的耐受性。致病力鉴定显示Lt GPX3基因敲除严重削弱了病原真菌L.theobromae对桃枝条的侵染能力。此外,在ΔLt GPX3突变体接种的枝条中,ROS的含量以及植物抗性基因的表达量均显著高于野生型菌株侵染的枝条。综述所述,Lt GPX3作为谷胱甘肽过氧化物酶参与ROS清除以及影响病原菌的致病力。4. 本研究在ΔLt AP1突变体的基因表达谱中获得1个显著下调表达,编码硫氧还蛋白的基因Lt TRX2。该基因含有2个内含子,编码的蛋白由156个氨基酸组成。Lt TRX2的基因表达受氧化剂的显著诱导。相对于野生型,ΔLt TRX2突变体对细胞壁损伤胁迫和细胞膜损伤胁迫更为敏感,但是,突变体对高渗透压胁迫和高盐胁迫表现出更强的耐受性。ΔLt TRX2突变体对氧化胁迫的敏感性显著高于野生型菌株。在离体枝条上进行的致病力测定显示ΔLt TRX2突变体接种的枝条上产生了更小的褐色坏死病斑和更低的真菌相对含量;而在接种ΔLt TRX2突变体的枝条中,Pp RBOHD/F的转录水平和超氧阴离子、过氧化氢的含量均显著高于对照组的枝条。综述所述,Lt TRX2作为重要的硫氧还蛋白参与ROS清除,抑制寄主抗性,以及参与病原菌的致病过程。