论文部分内容阅读
目的：越来越多的证据表明在肿瘤的发生发展过程中,耐药和转移的发生可能不是两个孤立的过程,两者之间存在一种功能上的联系。前期实验发现应用RNA干扰技术降低Anxa2的表达量后耐药乳腺癌细胞的转移能力明显降低。说明Anxa2表达升高可能是耐药乳腺癌细胞转移能力增强的重要原因。众所周知,肿瘤耐药的发生80%是由P-glycoprotein(P-gp)介导的。我们实验室前期实验表明在乳腺癌耐药细胞中,Anxa2的表达随着MDR1的升高而同步升高,免疫荧光检测也证实两种蛋白之间存在良好的共定位,我们推测P-glycoprotein和Anxa2的相互作用促进耐药乳腺癌细胞的转移。本研究应用免疫共沉淀、免疫荧光、Westren blotting、ShRNA等多种实验技术,研究P-glycoprotein的表达和活性改变对Anxa2的表达和酪氨酸磷酸化的影响,并深入探讨这种协同作用促进耐药肿瘤细胞转移能力的分子机制。方法：1.采用RNA干扰技术使人多药耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞中P-glycoprotein蛋白的表达水平下降,并用Westren blotting技术验证其表达水平。2.应用噻唑蓝(MTT)比色法实验检测P-glycoprotein降表达对MCF-7/ADR细胞增殖能力的影响,以及细胞对阿霉素的敏感性。3.流式细胞术用来检测P-glycoprotein抑制剂是否对P-glycoprotein泵的活性有效。4.应用体外迁移和侵袭实验检测P-glycoprotein表达水平下降后对多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR体外迁移和侵袭能力的影响。5.免疫共沉淀技术用来检测P-glycoprotein和Anxa2的相互作用,同时采用免疫荧光技术来观察二者在细胞内的共定位情况,再结合划痕实验进一步分析二者对细胞迁移的影响6.应用Westren blotting和免疫共沉淀技术来研究ERK1/2信号通路和Anxa2的酪氨酸磷酸化的变化,从而探讨这种协同作用促进耐药肿瘤细胞的转移能力增强的分子机制。结果：1.应用RNA干扰技术,按照转染试剂的说明书转染MCF-7/ADR细胞后,筛选到三株稳定的P-glycoprotein降表达的单克隆细胞。2. P-glycoprotein降低表达后MCF-7/ADR的增殖能力无明显改变,但其耐药能力都有明显的下降。3.体外侵袭实验结果表明P-glycoprotein蛋白表达水平下降后MCF-7/ADR的迁移和侵袭能力明显被抑制。4.免疫共沉淀技术发现P-glycoprotein和Anxa2在MCF-7/ADR细胞中存在相互作用,应用免疫荧光技术发现二者在细胞膜上存在良好的共定位。划痕实验也表明二者共定位于划痕边缘的细胞膜上。5. Westren blotting实验结果显示在MCF-7/ADR细胞中无论是降低P-glycoprotein的表达还是抑制其活性,都影响了阿霉素诱导的ERK1/2的磷酸化。6.免疫共沉淀检测发现P-glycoprotein能调节Anxa2的酪氨酸磷酸化水平。结论：1.在多药耐药MCF-7/ADR细胞中,P-glycoprotein和Anxa2存在相互作用并且在细胞膜上存在良好的共定位。2. P-glycoprotein表达水平降低和抑制其活性后,MCF-7/ADR细胞的迁移能力明显下降,体外侵袭能力也明显减弱。3.进一步的机制研究结果显示：在多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR中P-glycoprotein通过调节Anxa2的酪氨酸磷酸化和激活ERK1/2通路来促进肿瘤细胞的体外迁移和侵袭能力。进一步说明肿瘤耐药和转移的发生不是一个孤立的事件,两者之间存在功能上的相关性。