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细胞穿膜肽CPP(Cell Penetrating Peptide)也称为蛋白转导域,它是一类能携带蛋白质、多肽等一些其他的生物大分子穿过哺乳动物细胞膜的短肽,可以使有治疗作用的蛋白质、多肽等穿过细胞膜进入细胞发挥生物学作用并保持生物活性。细胞穿膜肽在HIV-1中首次被发现,HIV-1中反式激活蛋白(HIV-1-transactivator protein,TAT)拥有特殊的穿膜能力,能够穿过细胞膜进入细胞,它的一段特殊穿膜的核心序列包括11个氨基酸,序列为YGRKKRRQRRR。自从TAT发现以来,许多肽被添加到CPP家族中,其中包括人工合成的多聚精氨酸R9,多聚精氨酸R9由9个精氨酸融合组成的细胞穿膜肽。细胞穿膜肽TAT和R9有着的不同氨基酸序列,因此在细胞穿膜的过程中它们的效率和穿膜机制等都不尽相同;在利用细胞穿膜肽行驶其本身的功能时,会依据各个细胞穿膜肽之间不同的特性选择相应的细胞穿膜肽。本研究主要比较了两种分别融合绿色荧光蛋白的细胞穿膜肽TAT和R9的体外穿膜效率和小鼠体内分布情况的异同。通过将自己构建的pHis-Tat-eGFP的质粒和实验室已有的pHis-R9-eGFP,转化大肠杆菌表达TAT-EGFP和R9-EGFP菌株,根据蛋白纯化的影响条件温度、时间、诱导剂的不同,探究了穿膜蛋白TAT-EGFP和R9-EGFP的最佳纯化条件,采用His-tag亲和纯化方法,制备并纯化出穿膜蛋白TAT-EGFP和R9-EGFP,同时在人骨肉瘤细胞U2OS中验证了它们的穿膜活性。通过不同的方法比较TAT-EGFP和R9-EGFP在不同细胞中的穿膜效率和在小鼠体内的穿膜和分布情况。实验结果显示,本研究成功构建了pHis-Tat-eGFP;通过对纯化条件的探索发现TAT-EGFP的最佳纯化条件是时间12小时,温度28℃,诱导剂0.8mM;R9-EGFP的最佳纯化条件是时间4小时,温度28℃,诱导剂0.8mM。我们利用His-tag亲和纯化方法,纯化出亮绿色的TAT-EGFP和R9-EGFP,并证实两种穿膜肽能够穿入细胞且保持生物功能。通过荧光成像、细胞计数和流式细胞仪比较两种融合蛋白的穿膜效率发现R9-EGFP在乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549和宫颈癌细胞Hela中的穿膜效率均高于TAT-EGFP。通过小鼠体内实验发现两种穿膜肽能够进入在各主要器官,也能通过血脑屏障入脑。相对来说,TAT-EGFP在小鼠活体中的穿膜效果更好,荧光富集多,R9-EGFP整体穿膜效果较弱。本实验通过比较两种细胞穿膜肽的差异,为在不同的应用中如何选择合适的细胞穿膜肽提供了借鉴方向。