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目的:构建小鼠CCR3基因慢病毒shRNA载体质粒并进行鉴定,利用干扰载体沉默小鼠骨髓源性肥大细胞CCR3基因,进一步研究CCR3基因对小鼠肥大细胞的增殖、凋亡、趋化及脱颗粒的影响,建立可能的干预手段寻找到新的分子靶点。方法:1.体外培养并纯化小鼠骨髓源性的肥大细胞,用甲苯胺蓝染色法及流式细胞仪进行细胞鉴定。2.构建CCR3基因慢病毒shRNA载体:在线设计3条目的基因干扰序列,将其连接到PDSO19-PL RNA干扰慢病毒载体并转入感受态细胞中,待形成单克隆菌落后进行PCR测序鉴定,测序比对正确的克隆即为所需的CCR3基因RNAi慢病毒载体。3.慢病毒包装及滴度测定:提取高纯度、无内毒素的慢病毒shRNA载体及其辅助载体,通过Lipofectamine 2000将两者共转染到293T细胞,通过换液、培养、离心等处理后获取上清液,进一步浓缩后获取高滴度慢病毒浓缩液,并在293T细胞中标定其病毒滴度。4.干扰载体质粒对小鼠肥大细胞内CCR3基因的沉默检测:用包装好的慢病毒转染小鼠肥大细胞,转染成功后用qRT-PCR方法评价干扰载体对靶基因的沉默效果,选择最优干扰质粒。5.用qRT-PCR和Western Bolt检测各组肥大细胞内CCR3基因mRNA及蛋白的表达情况。6.CCK8实验及流式细胞凋亡检测各组肥大细胞增殖及凋亡情况。7.Transwell实验检测各组肥大细胞的趋化情况。8.Elisa实验检测肥大细胞的激活脱颗粒情况。结果:(1)对已构建的3条慢病毒干扰载体进行PCR测序鉴定,DNA序列与CCR3-shRNA1-3寡聚单链正链序列完全一致,证实CCR3基因干扰载体构建成功。(2)用慢病毒干扰载体质粒转染293T细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光,并在293T细胞中进行病毒包装,最终可获取高纯度的PDSO19-PL-CCR3慢病毒质粒。(3)慢病毒干扰载体质粒转染小鼠肥大细胞后,经qRT-PCR实验检测发现3条shRNA对小鼠肥大细胞CCR3基因均有一定的沉默,其中以shCCR-3-2沉默效率最高。(4)RT-PCR和Western Bolt表明CCR3shRNA能明显抑制小鼠肥大细胞的CCR3 mRNA和蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)CCK8及流式细胞凋亡检测表明CCR3shRNA能够抑制小鼠肥大细胞的增殖并促进肥大细胞的凋亡,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)Transwell检测表明CCR3shRNA能够抑制肥大细胞的趋化,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)Elisa检测表明CCR3shRNA能够抑制肥大细胞的脱颗粒,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:通过RNAi技术,成功构建了小鼠CCR3基因慢病毒shRNA载体质粒,其中以CCR3-shRNA2沉默效率最高;CCR3-shRNA2能够有效的下调了小鼠肥大细胞CCR3基因mRNA及蛋白水平的表达,同时能够促进小鼠肥大细胞的凋亡并抑制小鼠肥大细胞的增殖、趋化及脱颗粒,可考虑作为治疗过敏性鼻炎的治疗靶点。