一、研究目的及意义黑色素瘤是一种多发于皮肤的恶性肿瘤,近年来其发病年龄趋于年轻化,内脏发病有增高趋势,临床治疗效果差,死亡率极高,传统的手术切除、放化疗等治疗方法并没有取得理想的治疗效果。随着分子生物学的发展,对肿瘤认识的深入,以自杀基因为主的基因治疗受到人们广泛的关注,并成为继手术切除、放疗、化疗等传统方法后的一种新的抗肿瘤治疗措施。它弥补了传统疗法的不足,给黑色素瘤患者带来了希望。但是该疗法由于存在基因转染效率较低、靶向性不足等问题,单纯的自杀基因治疗难以完全清除所有的肿瘤细胞；另外,自杀基因治疗多以病毒为载体,其病毒载体对人体也具一定的毒副作用；如何在低转染的情况下增强该疗法对肿瘤的杀伤效应就显得极为关键。自杀基因疗法的一个重要特点是具有旁杀伤效应,即转染基因的阳性细胞对未转染基因的阴性细胞的杀伤效应,这一显著特点成为了自杀基因疗法增效的重要靶点,如何提高其旁杀伤效应成为抗肿瘤研究的重点内容。导师课题组前期研究工作表明：姜黄素、白藜芦醇、丹参酮ⅡA、薯蓣皂甙元、菝葜皂甙元、枸杞多糖、木犀草素、山奈酚等中药活性成分及中药经典复方六味地黄丸入血成分等能够通过旁杀伤效应的缝隙连接机制、细胞凋亡机制和免疫机制等来增强自杀基因的旁观者效应,从而实现协同抗肿瘤的作用；木研究在前期中药增效成分筛选、复方抗肿瘤研究以及对免疫活性中药成分人参总皂苷对黑色素瘤自杀基因疗法增效作用研究的基础上,基于自杀基因疗法的旁杀伤效应机制以及中医学肿瘤病机,从已筛选的有效增效中药成分中选取能增强旁杀伤效应的缝隙连接机制和具有清热解毒及活血化瘀作用的白藜芦醇、丹参酮ⅡA与具有免疫活性及补虚作用的人参总皂苷组成中药成分组方(RTGE),以B16细胞株及小鼠黑色素瘤移植瘤为研究对象,探讨研究基于旁杀伤效应机制的肿瘤自杀基因疗法增效中药成分组方的可行性。二、研究方法：1人参总皂苷对黑色素瘤HSV-tk/GCV自杀基因治疗增效作用的研究1.1人参总皂苷对小鼠黑色素瘤移植瘤HSV-tk/GCV自杀基因疗法的增效作用：85只SPF级雄性C57BL/6J小鼠,除正常对照组小鼠于右前肢腋下注射生理盐水,0.1mL/只,其它小鼠于右前肢腋下接种含20% B16tk的B16tk与B16混合细胞(模拟临床体内病毒感染肿瘤细胞比率的10%-20%)0.1mL/只(细胞浓度2×106个/mL),接种后第7天造模成功(触及芝麻粒大小肿瘤)后将其随机分为模型对照组、自杀基因治疗组(GCV治疗组)、人参总皂苷治疗组、联合治疗组(自杀基因联合人参总皂苷治疗组)。正常对照组、模型对照组接种后第7-14天每天上午腹腔注射含10%无水乙醇的生理盐水0.2mL/只,连续7d；自杀基因治疗组接种后第7-14天每天下午腹腔注射GCV 0.2mL/只(100mg/kg·d);人参总皂苷治疗组接种后第7-14天每天上午腹腔注射人参总皂苷0.2mL/只(100mg/kg·d),连续7d；联合治疗组接种后第7-14天每天上午腹腔注射人参总皂苷0.1 mL/只(100mg/kg·d),下午腹腔注射GCV (0.1mL/只(100mg/kg·d)连续7d；用游标卡尺每天测肿瘤的长径A和短径B,并计算其体积。接种后第14天处死老鼠取肿瘤,称其重量,拍下肿瘤照片,并进行病理组织学检查。1.2病理组织学检查剥离瘤块按组.从大到小排列拍照后,肿瘤用10%中性甲醛固定；肉眼观察肿瘤大小、颜色、坏死情况等；常规石蜡切片,HE染色,光镜观察肿瘤组织坏死、包膜的增生情况及淋巴细胞的浸润情况并摄片。淋巴细胞浸润进行半定量分析,分级标准为：-：无淋巴细胞浸润；+：见散在淋巴细胞；++：见多量淋巴细胞；+++：见密集淋巴细胞成团或成堆。1.3人参总皂苷对B16细胞的生长抑制作用：用终浓度为0μg/mL、1μg/mL 10μg/mL、100μg/mL的人参总皂苷作用于B16细胞24h、48h,MTT法检测各浓度组细胞的抑制率。1.4 HSV-tk/GCV自杀基因联合人参总皂苷对B16细胞的杀伤效应：用含20%B16tk细胞的B16tk与B16混合细胞铺96孔板,用终浓度为0μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、125μg/mL的人参总皂营与终浓度为15.7μM的GCV联合作用48h, MTT法检测各浓度组细胞的抑制率,比较分析各浓度组细胞抑制率的差异,用金正均Q值分析人参总皂苷与HSV-tk/GCV自杀基因系统的联合作用是否具有协同性。2白藜芦醇、丹参酮ⅡA.与人参总皂苷组方对黑色素瘤HSV-tk/GCV自杀基因治疗增效作用的研究2.1白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂营联合对B16细胞的生长抑制作用：用总浓度分别为12.5μg/mL(低浓度)、25μg/mL(中浓度)、50μg/mL(高浓度)的三中药成分组方分别作用于B16细胞24h、48h, MTT法检测各组细胞抑制率。2.2 HSV-tk/GCV自杀基因联合白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂苷组方对B16细胞的杀伤效应：用含20%B 16tk的B16tk与B16混合细胞铺96孔板,用总浓度分别为12.5μg/mL(低浓度)、25μg/mL(中浓度)、50μg/mL(高浓度)的三中药成分组方与终浓度为15.7μM的GCV(本课题组前期已经证实GCV的最佳浓度为15.7uM/L)联合作用48h,MTT法检测各浓度组细胞的抑制率,比较分析各浓度组细胞抑制率的差异,用金正均Q值分析三中药成分组方与自杀基因系统的联合作用是否具有协同性。2.3 HSV-tk/GCV自杀基因联合白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂苷组方对B16细胞的凋亡指数的影响：用含20% B16tk细胞的B16tk和B16混合细胞铺6孔板,设置对照组、中药成分组方组(总浓度50μg/mL)、自杀基因治疗组、联合治疗组(GCV的终浓度为15.7μM),流式细胞技术分析各组细胞的凋亡指数。2.4白藜芦醇、丹参酮IIA与人参总皂苷组成的中药成分组方对小鼠黑色素瘤移植瘤HSV-tk/GCV自杀基因疗法的增效作用：SPF级雄性C57BL/6J小鼠,除正常对照组小鼠于右前肢腋下注射生理盐水,0.1 mL/只,其它小鼠于右前肢腋下接种含20% B16tk的B16tk与B16混合细胞0.1mL/只(细胞浓度2×106个/mL)。接种后第7天造模成功(触及芝麻粒大小肿瘤)后将其随机分为模型对照组、自杀基因治疗组(GCV治疗组)、中药成分组方治疗组(白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂营联合治疗组)、联合治疗组(自杀基因联合中药成分组方治疗组)。正常对照组.组、模型对照组接种后第7-14天每天上午腹腔注射含10%无水乙醇的生理盐水0.2mL/只,连续7d；自杀基因治疗组接种后第7-14天每天下午腹腔注射GCV 0.2mL/口(100mg/kg·d),连续7d；中药成分组方治疗组接种后第7-14天每天上午分别腹腔注射白藜芦醇0.05mL/只(100mg/kg·d)、丹参酮ⅡA 0.05mL/只(100mg/kg·d)、人参总皂苷0.1mL/只(100mg/kg·d)连续7d；联合治疗组接种后第7-14天每天上午分别腹腔注射白藜芦醇0.05mL/只(100mg/kg·d)、丹参酮ⅡA 0.05mL/只(100mg/kg·d)、人参总皂苷0.05mL/只(100mg/kg·d),下午腹腔注射GCV 0.05mL/只(100mg/kg·d),连续7d；游标卡尺每天测肿瘤的长径A和短径B,并计算其体积。接种后第14天处死小鼠取肿瘤,称其重量并拍下肿瘤照片。三、研究结果1人参总皂苷对黑色素瘤HSV-tk/GCV自杀基因治疗的增效作用研究1.1人参总皂苷对小鼠黑色素瘤移植瘤HSV-tk/GCV自杀基因疗法的增效作用：动物实验结果表明,各治疗组肿瘤质量均较模型对照组低,联合治疗组与模型对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；自杀基因治疗组、人参总皂苷治疗组与模型对照组两两比较,差异无统计学意义(P>0.05),自杀基因治疗组、人参总皂苷治疗组.、联合治疗组的抑瘤率分别为16.22%、17.26%、32.29%,联合治疗组的抑瘤率最高,表明人参总皂苷对黑色素瘤移植瘤的HSV-tk/GCV自杀基因治疗具有增效作用。1.2病理组织学检查病理切片结果提示人参总皂苷治疗组及联合治疗组的淋巴细胞浸润明显,尤其是联合治疗组出现大量密集成团的淋巴细胞。对各组淋巴细胞的浸润程度进行等级排序,经秩和检验,自杀基因治疗组、人参总皂苷治疗组.、联合治疗组与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),联合治疗组与自杀基因治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。各治疗组淋巴细胞浸润的情况反映了人参总皂苷作用各组的小鼠机体的免疫力高于模型对照组,提示人参总皂苷对肿瘤自杀基因治疗的增效作用可能是通过旁杀伤效应的免疫机制途径实现的。1.3人参总皂营对B16细胞的生长抑制作用：MTT结果显示,加药作用24h,终浓度为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL人参总皂苷对B16细胞的抑制率分别为-9.8%、2.0%、8.8%；低浓度时还出现促进肿瘤细胞生长的情况；加药作用48h,1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL浓度组对B16细胞的抑制率分别为2.3%、2.7%、10.3%,提示单独人参总皂苷对B16细胞的增殖抑制程度不高。1.4 HSV-tk/GCV自杀基囚疗法联合人参总皂苷对B16细胞的杀伤作用：MTT结果显示,加药作用72h,5μg/mL、25μg/mL、125μg/mL的人参总皂苷联合自杀基因各组的抑制率分别为19.5%、25.2%、39.6%,25μg/mL、125μg/mL的联合组与单独自杀基因组比较差异有统计学意义(P<<0.05)；协同性分析显示各浓度联合用药组的金正Q值分别为0.67、0.69、0.85,均小于1.15,表明人参总皂苷对B16细胞HSV-tk/GCV自杀基因治疗的体外实验增效作用没有协同性。2白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂苷组方对黑色素瘤HSV-tk/GCV自杀基因治疗增效作用的研究2.1白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂苷组成的中药成分组方对B16细胞的生长抑制作用：MTT结果显示：加药后24h,低浓度(12.5μg/mL)、中浓度(25μg/mL)、高浓度(50μg/mL)的三药成分组方各组对B16细胞抑制率分别为16.2%、29.1%、44.3%,24h IC5o约为61.7μg/mL;加药后48h,各浓度组的细胞抑制率分别为32.0%、59.6%、67.0%,48h IC50约为22.4μg/mL,该三药成分组方对B16细胞的抑制作用具有明显的时效与量效关系。2.2 HSV-tk/GCV自杀基因联合白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂苷组成的中药成分组方对B16细胞的杀伤效应：MTT结果提示：加药作用后48h,低浓度(12.5μg/mL)、中浓度(25μg/mL)、高浓度(50μg/mL)的联合治疗组的细胞抑制率分别为：30.8%、44.7%、65.3%,与单独自杀基因组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；协同性分析显示各浓度的金正均Q值分别为0.91、0.96、1.16,高浓度组的金正均Q值大于1.15,表明白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂苷组成的中药成分组方对B16细胞株tk/GCV自杀基因治疗具有协同增效作用。2.3 HSV-tk/GCV自杀基因联合白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂苷组成的中药成分组方对B16细胞凋亡指数的影响：流式结果显示联合治疗组的细胞凋亡率要高于同浓度的单纯中药成分组方治疗组和单纯自杀基因治疗组,说明白藜芦醇、丹参酮IIA与人参皂苷组方对B16细胞HSV-tk/GCV自杀基因系统的增效作用可能通过促进细胞凋亡途径实现。2.4白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂苷组成的中药成分组方对小鼠黑色素瘤移植瘤HSV-tk/GCV自杀基因疗法的增效作用：动物实验的结果表明,各治疗组肿瘤质量均较模型对照组轻,联合治疗组与模型对照组、自杀基因治疗组两两比较差异有统计学意义(p<0.05)；自杀基因治疗组、中药成分组方治疗组分别与模型对照组、自杀基因治疗组两两比较差异无统计学意义(p>0.05)。自杀基因治疗组、中药成分组方治疗组、联合治疗组的抑瘤率分别为16.22%、21.62%、44.22%,联合治疗组的抑瘤率最高,计算其金正均Q值大于1.15,表明白藜芦醇、丹参酮ⅡA与人参总皂苷组成的中药成分组方对小鼠黑色素瘤移植瘤的自杀基因疗法具有协同增效作用,说明该三药组成的中药成分组方协同自杀基因治疗恶性黑色素瘤的方法是可行的。四、结论实验结果表明,人参总皂苷可以通过提高荷瘤小鼠机体免疫力,从而通过旁杀伤效应的“免疫机制”途径来实现对黑色素移植瘤自杀基因治疗的增效作用；白藜芦醇、丹参酮ⅡA、人参总皂苷组成的中药成分组方不仅在体外实验中显示出对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤B16肿瘤细胞的增效作用,而且对小鼠恶性黑色素瘤移植瘤的自杀基因治疗同样具有增效作用,结合导师课题组前期的研究结果,其增效作用可能与缝隙连接、细胞凋亡、细胞免疫等机制共同作用有关。