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矮化密植集约化经营是未来苹果产业发展的方向,而矮化砧木是实现矮化密植的重要材料基础。传统的矮化自根砧繁育模式为压条,与压条相比,绿枝扦插繁殖效率高、育苗周期短、育苗成本低,但限制因素在于不定根发生诱导困难。前人通过连续组培继代实现成龄树的返童,返童后的’中砧1号’和M26绿枝扦插生根率分别可以达到85.40%和81.82%,满足产业化需求。但成龄期苹果砧木扦插难生根的机制仍未揭示。前人研究表明,童性和生长素对苹果砧木不定根发生都是必须的。本研究在前人工作的基础上,以中砧1号童期(Mx-J)和成龄期(Mx-A)材料为研究对象,qRT-PCR结果显示童期插穗miR156表达水平显著高于成龄期,通过miR156过表达和抑制表达转基因烟草试验,明确了 miR156的高表达和外源生长素诱导均为不定根发生的必要条件。在明确了 miR156对不定根发生起直接调控作用的基础上,通过检测Mx-A、Mx-J插穗、miR156过表达和抑制表达转基因烟草不定根发生过程中生长素响应因子基因(ARF)和生长素极性运输蛋白基因(PIN)的表达模式发现,ARF和PIN的表达在Mx-A和Mx-J或者miR156过表达和抑制表达材料中均无显著差异,暗示miR156影响生根不依赖调控ARF和PIN表达。Mx-J和miR156过表达烟草中RTCS (rootless concerning crownandseminal roots)基因表达量在不定根发生过程中显著提高,可能是其不定根发生能力显著提高的原因。苹果上共有13个miR156靶向的SPL基因,通过对MxrSPLs转基因烟草不定根发生能力的分析发现,表明miR156靶向的MxSPL20、MxSPL21&22和MxSPL26均能抑制不定根发生;进一步研究表明MxSPL26在这一过程起主导作用,在MxSPL26过表达转基因烟草中,NbRTCS基因表达受到抑制,这表明mmiR156可以通过MxSPL26调控RTCS基因表达,进而影响不定根发生。以Mx-A和Mx-J绿枝插穗为材料,在IBA和对照处理Oh、6 h、12 h、24 h和48 h去茎皮韧皮部组织,进行转录组测序发现,IBA处理后6 h -12 h,Mx-A插穗中homeoboxprotein 13(HB13)显著下调表达,随后12h-24h调节蛋白基因(NPR)显著下调表达,处理后24h-48 h Homeobox protein 2 (HB2)、 Dof zinc finger protein (DOF5.4) 、 NAC domain-containing protein(NAC78)和Protein lin-54 homolog 4个转录因子基因显著下调表达,在处理后12 h - 48 h生长素运输蛋白基因、生长素诱导蛋白基因和生长素响应蛋白基因(AUX/IAA)显著下调表达,以及kinesin-related家族基因、elongation factor家族基因、expansin相关基因、G2/有丝分裂-周期蛋白、微管相关蛋白(MT)、聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)和tubulin家族基因等细胞分裂分化相关基因显著下调表达,表明成龄期’中砧1号’主动抵抗IBA,抑制不定根发生。Mx-J插穗在IBA处理后6hNAC29和MYC2两个转录因子基因显著上调表达,12 h时SBP5、ERF003 和WRKY75,24h时MAD - o 转录因子,48 h 时WRKY29 和 Zinc finger CCCHH domain蛋白(C3H67)均显著上调表达,启动不定根发生。另外,还发现γ-氨基丁酸(GABA)合成限速基因谷氨酸脱羧酶(GAD)在Mx-A中受IBA诱导显著上调表达,外施4 mM以上浓度的GABA显著抑制不定根发生,因此GAD显著上调表达可能也是Mx-A难生根的原因之一。