根结线虫是一种极难防治的世界性分布的土传病害,每年可给农业造成约1000亿美元的损失,己然成为制约我国蔬菜种植业可持续发展的问题之一。由于根结线虫体积小,不能人工培养,世代长等难于进行体外与宿主的相互作用方面的研究,进展一直很缓慢。1998年在秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)上发现了RNAi沉默现象,并于同一年完成全基因组测序,人们对C.elegans的关注度越来越高。随着RNAi机制的明确和应用技术的逐渐成熟,大规模、高通量鉴定C.elegans全基因组的功能逐渐展开。若能利用C.elegans的信息资源为研究根结线虫服务,将大大推动相关技术的发展。本文利用生物信息学技术对根结线虫的ESTs库和C.elegans的全基因组蛋白库进行了比对,得到一批有用的数据,为大规模确定植物寄生线虫基因功能奠定了基础。主要研究结果如下:1.利用温室条件,改进高效培养和收集根结线虫J2幼虫的方法,为后续大规模使用线虫材料提供了保障。实验证明采用改进的贝尔曼漏斗法,把纱布换成60目筛网,在筛网上铺一层面巾纸,可以使线虫通过而把杂质隔离开,能够最大程度地减少线虫收集的损失。2.采用生物信息学分析鉴定物种基因功能的方法。本研究利用充分的网络数据资源和现代生物信息学技术,比对了根结线虫ESTs库2455条序列和C.elegans的基因组蛋白库23212条序列,得到444个同源性很高的序列。结合比较基因组学和功能基因组学分析两个物种基因信息,从而推测南方根结线虫(Meloidgyneincognita)的基因功能,相比经典遗传学,此法可大规模预测物种的基因功能。然后根据C.elegans RNAi效果挑选具有胚致死效应序列进行功能验证。所选基因要符合两个条件才能做交叉干扰:第一,该基因序列与模式线虫至少有连续的21-23 nt的精确匹配;第二,几百个碱基内该序列与模式线虫的基因同源性要高于60%。因此,我们选择了其中4个具有胚致死效应基因的片段进行交叉RNAi功能鉴定。3.应用并证实了物种间“交叉干扰RNAi”技术。我们通过构建载体,把4个M.incognita基因片段插入到表达dsRNA的载体LITMUS 28i中,通过IPTG诱导体内合成dsRNA,干扰C.elegans。RNAi基因沉默技术相比传统基因敲除技术,具有大规模、高效、快捷、省时省力、容易观察等优势,是传统方法不可比拟的。结果发现此4个基因在不同程度上对C.elegans的胚胎形成和阴门有一定影响。这表明,靶标基因在线虫胚胎发育阶段起重要作用。4.为了更明确此4个M.incognita基因片段的功能,本文采用1%的间苯二酚作为刺激物,体外转录合成dsRNA浸泡M.incognita J2幼虫。6h摇床悬浮浸泡后,可观察到处理线虫活性明显降低,再次证明沉默此4个基因片段对M.incognita具重要影响。由此证明本研究采用生物信息学技术分析基因功能的方法切实可行,为大规模鉴定物种全基因组功能提供了新的思路。本实验发现线虫长时间聚集容易死亡,采用摇床培养悬浮线虫溶液,大大改善了这一状况。