青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f)属禾本科大麦属,因其籽粒内外稃与颖果分离,籽粒裸露,故称裸大麦。青稞在我国成为栽培作物至少已有五千年的历史,主要分布在高寒缺氧和环境恶劣的高原地区,是一个基因资源十分丰富的种质资源。青稞是青藏高原种植面积最大的粮食作物,是藏区农牧民不可替代的主粮。研究表明裸大麦特别是种植于高海拔地区的裸大麦品种中的β-葡聚糖含量明显高于其他大麦。目前已证实β-葡聚糖具有降低胆固醇,减轻餐后血糖和胰岛素反应等多种药理活性。而来源于西藏自治区卫生防疫和有关医疗机构的信息也证实了在日常饮食结构中,食用青稞食品较多的人群的高胆固醇类疾病发病率较低。青稞有着“三高”、“两低”的特点,即高蛋白、高纤维素、高维生素,低脂肪、低糖。此外,青稞中还含有多种功能性成分,如戊聚糖和多酚等。但目前有关青稞对胆固醇的调节作用研究多集中在青稞β-葡聚糖的功效研究,而有关青稞全谷粉(Whole-grain Qingke,WGQ)对胆固醇的调节作用的研究相对较少,其作用机理尚不明确。由于肝脏和肠道是机体胆固醇代谢的重要部位。因此,本研究主要针对WGQ对高脂膳食大鼠肝脏和肠道胆固醇代谢的影响及其作用机理进行探索。主要研究结果如下:1.对WGQ(藏青320,Hordeum vulgare L.Zangqing 320)的基本组分、主要活性成分和抗氧化性进行测定。结果表明,WGQ的灰分(1.95±0.08 g/100g)、蛋白质(17.00±0.26 g/100g)、β-葡聚糖(5.77±0.28 g/100g)、总膳食纤维(19.01±0.54g/100g)、可溶性膳食纤维(9.28±0.01 g/100g)、总戊聚糖(10.74±0.47 g/100g)、总多酚(259.90±0.96 mg/100g)和游离多酚(149.07±2.71 mg/100g)含量相对较高。而脂肪(1.03±0.02 g/100g)、不溶性膳食纤维(11.64±0.95 g/100g)和水溶性戊聚糖(0.44±0.03 g/100g)含量相对较低。采用乙醇、NaOH、甲醇和水对WGQ中的抗氧化物质进行梯度萃取,对提取物的氧自由基吸收能力(Oxygen radical absorbance capacity,ORAC)进行测定。WGQ提取物的总ORAC为418.05±5.65μmol/g。因此,WGQ具有较高含量的功能性组分和较高的抗氧化性。最后对指标间的相关性进行分析,WGQ中的β-葡聚糖、多酚和戊聚糖含量与其抗氧化性之间存在正相关(P<0.01),说明上述几种组分可能具有抗氧化性。2.以72只雄性Sprague-Dawlay(SD)大鼠为研究对象,研究WGQ的降血脂效果。将大鼠分为四个试验组:阴性对照组(Normal control group,NC)膳食普通饲料;高脂空白对照组(Blank control group,BC)膳食高脂饲料;WGQ低剂量组(Low dose group,LD)饲喂含有100 g/kg WGQ的高脂饲料;青稞高剂量组(High dose group,HD)饲喂含有489.5 g/kg WGQ的高脂饲料,试验周期分为4周和8周。对大鼠的体重和Lee‘s指数进行分析,结果表明WGQ饲喂组(LD和HD组)的体重增加量均高于BC组,其中HD组明显高于BC组。HD组的Lee‘s指数在饲喂8周时显著性(P<0.05)低于其他各组。表明对高脂膳食大鼠添食WGQ,特别是高剂量的WGQ后虽会增加大鼠的体重,但会减轻大鼠肥胖程度。对脏器指数进行分析,HD组的肝脏和腹部脂肪指数与BC组相比显著性(P<0.05)降低。说明WGQ影响肝脏代谢,并可减轻大鼠体内脂肪蓄积。对血清脂质水平进行测定,与BC组相比,LD组的大鼠血脂水平虽有下降趋势,但差异不显著。而HD组的大鼠在饲喂8周时,血清总胆固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、非高密度脂蛋白胆固醇(Non-high-density lipoprotein cholesterol,non-HDL-C)水平和致动脉粥样硬化指数(Atherogenic index,AI)显著(P<0.05)低于BC组,高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平显著(P<0.05)高于BC组。说明高剂量的WGQ膳食8周后可显著降低高脂膳食大鼠血脂水平,减轻动脉粥样硬化风险。3.研究大鼠肝脏脂质水平和肝脏中参与胆固醇代谢的相关基因的变化,以探讨WGQ对高脂膳食大鼠肝脏胆固醇代谢的影响及机理。对肝脏TC、TG和总胆固醇水平进行测定,结果表明饲喂4周和8周时各高脂膳食组(BC、LD和HD组)大鼠的肝脏TC、TG和总脂水平显著(P<0.05)高于NC组。膳食8周后,HD组的肝脏TC和总脂质水平显著(P<0.05)低于BC组。进一步通过肝脏组织切片对肝细胞组织形态学进行观察,与BC组相比,LD组肝脏细胞脂肪变性略有减轻。HD组脂肪变性情况明显好转,在饲喂8周后肝细胞内脂肪滴与BC组相比明显收缩。说明高剂量的WGQ膳食8周可显著降低肝脏脂肪含量。对肝脏中参与胆固醇合成、外周组织胆固醇积累或胆汁酸合成的生物标志物的基因进行荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)分析。参与胆固醇合成的标志物中,HD组的5’-腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinaseα,AMPKα)mRNA水平显著(P<0.05)高于BC组,3-羟基-3-甲基辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMG-CoAr)的mRNA水平显著(P<0.05)低于BC组;参与外周组织胆固醇积累的标志物中,膳食8周时,HD组的低密度脂蛋白受体(Low-density lipoprotein receptor,LDL-R)、肝X受体(Liver X receptor,LXR)和过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)的mRNA水平与BC组相比显著(P<0.05)上调;参与肝脏胆汁酸合成的标志物中,膳食8周时HD组的胆固醇7α-羟化酶(Cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)的mRNA水平显著(P<0.05)高于BC组。因此,WGQ可能是通过调节肝脏中参与胆固醇代谢的生物标志物(AMPKα、HMG-CoAr、LDL-R、LXR、PPARα和CYP7A1)的表达调节肝脏胆固醇代谢,降低肝脏胆固醇水平。4.为了进一步研究WGQ对肝脏脂质代谢的影响机制,对高脂膳食大鼠添食WGQ 8周时的肝脏CYP7A1,HMG-CoAr和LDLR的蛋白表达量进行研究。蛋白免疫印迹结果表明,与BC组相比,HD组大鼠肝脏CYP7A1和LDLR的蛋白表达量显著上调,而HMG-CoAr的蛋白表达量显著下调。同时对肝脏蛋白质组学进行研究,经二维凝胶电泳分离、质谱分析和数据库比对,共成功鉴定出7个差异蛋白点。KEGG分析结果显示这些差异蛋白点的代谢通路涉及脂质代谢、能量代谢、碳水化物代谢等多个方面。进一步对涉及脂质代谢的4个蛋白点进行RT-PCR分析。结果表明WGQ干预后高脂膳食SD大鼠的热休克蛋白60(Heat shock protein 60,HSP60)和磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(Phosphatidylethanolamine binding protein 1,PEBP1)的表达量下调,烯酰辅酶A水合酶(Enoyl-coenzyme A hydratase,ECH)和过氧化物酶6(Peroxiredoxin-6,PRDX6)的表达量上调。HSP60和PEBP1与动脉粥样硬化相关,ECH催化脂肪酸的β-氧化,PRDX6具有过氧化物酶活性,因此WGQ的摄入会促进高脂膳食大鼠脂肪酸的β-氧化,降低体内氧化应激反应,降低动脉粥样硬化风险。5.研究WGQ对高脂膳食大鼠肠道胆固醇代谢的影响。对大鼠粪便、小肠内容物和盲肠指标进行研究,结果表明,在试验过程中BC组粪便pH明显高于其他组,而HD组pH水平一直保持较低水平。膳食4周和8周时,HD组大鼠的粪便干重、盲肠总质量、盲肠壁表面积和盲肠内容物质量显著(P<0.05)高于NC、BC和LD组。与BC组相比,LD组大鼠小肠内容物胆汁酸水平,粪便胆汁酸和中性固醇水平略有升高,但差异不显著,而HD组大鼠的胆汁酸和中性固醇水平显著(P<0.05)升高。膳食4周和8周时,HD组中乙酸、丙酸、丁酸和总SCFA含量均显著(P<0.05)高于BC和LD组。说明高剂量的WGQ膳食可显著增加大鼠肠道发酵活性。对回肠中参与胆固醇代谢的生物标志物的mRNA和蛋白表达水平进行研究。结果表明,膳食4周和8周时,HD组中回肠顶端钠型胆汁酸协同转运子(Apical sodium-dependent bile acid transporter,ASBT)的mRNA和蛋白表达水平显著(P<0.05)低于BC组,而法尼酯X受体(Farnesoid X receptor,FXR)的mRNA水平显著(P<0.05)高于BC组。说明WGQ可通过下调ASBT的表达,可能部分归因于上调回肠FXR的表达,从而抑制胆汁酸的重吸收。6.研究WGQ对高脂膳食大鼠肠道菌群的影响,探讨肠道菌群在WGQ调节胆固醇代谢过程中的变化及作用。首先采取巢式PCR-变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术分析WGQ干预4周和8周后对高脂膳食大鼠盲肠和粪便菌群的影响。结果表明各组大鼠粪便和盲肠菌群组成相似,但突出的优势菌条带存在明显不同。各组大鼠菌群组成在饲喂4周和8周时均存在一定差异,此外,LD组与BC组和HD组的优势菌群存在较大的差异。经分析共得到共有条带15条,粪便特有条带1条和盲肠内容物特有条带5条。对条带进行二次DGGE和切胶回收后进行测序,序列的比对结果显示分离得到的条带中,除了2个条带分类水平不明外,其余19个条带分属于厚壁菌门和拟杆菌门。之后采用Illumina Miseq平台分析WGQ干预8周时大鼠盲肠菌群的变化。结果显示高脂膳食对大鼠盲肠菌群α-多样性无显著性影响,但高剂量WGQ会降低其α-多样性。经物种分类,样本中的微生物归属于23个门,其中厚壁菌门和拟杆菌门为主要优势门,在所有样本中总相对丰度>92.08%。在属分类水平上,样本中的微生物归属于204个属。普氏菌属在各组中均为优势属。随着WGQ摄入量的增加普氏菌属和丁酸弧菌属丰度增加,此外,多种细菌丰度降低。由于普氏菌属和丁酸弧菌属可产生SCFA,因此,WGQ可能通过选择性富集产SCFA细菌影响机体胆固醇代谢。本研究创新性地应用了多种技术从多个层面开展了WGQ对高脂膳食大鼠胆固醇代谢的影响及其胆固醇调节机制的研究,证实了WGQ膳食可调控高脂膳食大鼠胆固醇代谢并存在剂量时间效应,找到了肝脏和肠道中多个参与其调节作用的生物标志物,并提出WGQ可能通过选择性富集产SCFA细菌来调节高脂膳食大鼠胆固醇代谢,对WGQ功能食品的开发提供了理论依据。