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莱克多巴胺(Ractopamine, RAC)属β2-肾上腺素受体激动剂,临床上主要用于治疗支气管哮喘、支气管痉挛和产科疾病。莱克多巴胺与克伦特罗一样,能改变养分的代谢途径,促进动物体蛋白质沉积,同时抑制脂肪的合成和积累,最终改变胴体品质,加快动物的生长速度。然而,高剂量的RAC对动物有一定的毒副作用,人体食用了高RAC残留的动物性食品后,也会产生毒副作用。欧盟早已明确禁止在食用性动物中使用包括莱克多巴胺在内的所有p-肾上腺素兴奋剂类药物,美国虽允许使用,但对用量和操作程序有严格规定。中国也明文禁止使用,但生猪生产中非法使用RAC的现象仍很严重。国内外已经建立了多种检测RAC残留的理化检测方法,如HPLC和GC-MS等,这些方法虽然准确、敏感、有效,但均需要昂贵的仪器、专业的操作技能和复杂的样品前处理程序,且费时,不适合用于大批量样品的检测。ELISA方法是目前检测该药物最普遍的方法,具有快速、灵敏、操作简单和一次检测样品量大的特点,且样品前处理过程相对简单,检测结果与HPLC、GC-MS检测有较高致性,因而常用作筛查方法。本研究以单克隆抗体和酶联免疫吸附测定技术为基础,研制出针对RAC的单克隆抗体,并初步建立了检测RAC的间接竞争酶联免疫吸附法(CiELISA)。添加回收试验证明,建立的检测RAC残留的CiELISA可以用于样品残留的检测。1.RAC人工抗原的合成与鉴定。分别采用多元酸酐与混合酸酐联用法和碳二亚胺法将RAC与载体蛋白偶联,制备人工抗原RAC-BSA、RAC-HSA,通过紫外扫描和免疫学方法初步鉴定偶联成功。通过对比实验,选择RAC-BSA作为免疫原,RAC-HSA为包被原。2.RAC单抗的制备。用合成的RAC-BSA常规免疫BALB/c小鼠,五免后血清效价达1：32,000以上。利用单克隆抗体技术和酶免疫学检测方法筛选获得1株可持续分泌针对莱克多巴胺抗体的杂交瘤细胞株5D7。体内诱生法制备了抗RAC的腹水,蛋白浓度为21.3mg/mL,腹水效价为1：128,000。3.ELISA检测方法的建立。用5D7杂交瘤细胞株制备的抗RAC腹水制作RAC标准竞争曲线,线性方程为Y=-0.4095x+0.7134(R2=0.991),IC50为4.75ng/mL,LOD低于0.5ng/mL,LOQ为0.92ng/mL。特异性实验表明,该单抗对RAC的抑制率为100%,对其它一些p-兴奋剂的抑制率均小于0.1%。4.添加回收实验。将建立的CiELISA检测方法应用于猪肝的添加回收试验。当样品液作4倍以上稀释时,样品基质干扰基本消失。在0-50ng/mL范围内,曲线方程为：Y=-0.3972x+0.7237,相关系数R2=0.9892,IC50为5.31ng/g,LOD为0.41ng/g。用1、2、5、10、20、50ng/mL的莱克多巴胺标准液做添加回收试验,经检测肝脏中药物回收率在80%～100%之间,批内差异在3.28%～9.37%之间,批间差异在4.57%～10.27%之间。