研究背景膀胱出口梗阻(bladderoutletobstruction,BOO)是由各类膀胱颈和/或尿道病变导致的尿液流出阻力增加,表现为尿液排出障碍,是泌尿外科常见的一类疾病,常由膀胱颈口硬化、尿道狭窄、尿道瓣膜、良性前列腺增生等引起的阻塞所致,且多为膀胱出口部分梗阻(partialbladderoutletobstruction,pBOO)。pBOO会继发膀胱收缩及舒张功能的异常和顺应性的改变,是导致下尿路症状(lowerurinarytractsymptoms,LUTS)的常见原因。pBOO所造成的膀胱损害可不断进展,若长期管理控制不当会造成膀胱结构的严重损害,并由此进一步加剧膀胱功能的异常。通常情况下,解除梗阻可以缓解pBOO所造成的LUTS,但事实上仍有相当一部分患者在去除梗阻后仍有严重的膀胱功能障碍和难治性LUTS,这提示这些患者发生了继发于pBOO的不可逆的膀胱功能障碍,这也是pBOO治疗的难点。继发于pBOO的膀胱结构改变可能是导致这些不可逆的膀胱功能障碍的重要原因,但迄今为止仍没有有效的方法可以减轻或延缓继发于pBOO的膀胱损害的发生与进展。因此,有必要进一步了解pBOO后膀胱结构功能的改变及其内在机制。pBOO发生后膀胱结构、功能的损害是渐进且累加的过程。既往研究发现,pBOO发生后,膀胱内压力升高造成局部炎症并刺激尿路上皮水肿、增厚及诱导逼尿肌增生,过高的压力也会压迫膀胱壁内血管导致膀胱内局灶性缺血,这些改变会影响膀胱功能并造成一定的LUTS表现;同时,由此所致的代谢改变可诱导机体出现适应性机制,促进血管生成并使膀胱内血流量相对增加,再加上逼尿肌的增生,可在一定程度上实现pBOO后膀胱功能的代偿,使膀胱内尿液可以排出;但如果梗阻未及时解除,膀胱组织所遭受的压力环境长期存在,由此产生的持续的代谢紊乱及逐渐失控的组织损伤-修复机制可使膀胱损伤持续累加,使其最终转变为失代偿状态,导致以膀胱内胶原沉积、逼尿肌细胞凋亡等为特征的膀胱重塑,使膀胱发生纤维化改变并造成膀胱顺应性下降,这可能是pBOO导致不可逆的膀胱功能损伤的原因。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine5-monophosphate(AMP)-activatedproteinkinase,AMPK)可感受环境压力改变并被多种刺激激活,从而参与体内能量平衡和代谢调节,在多种疾病的发生、进展中发挥重要作用,对膀胱内能量代谢平衡的维持及氧化应激的调节也有重要作用。pBOO后会伴随着膀胱组织内系列的能量代谢及氧化应激的变化,多项研究已证实其与pBOO继发的膀胱结构、功能的异常密切相关,但AMPK的激活水平在pBOO后膀胱损伤过程中发生的改变、发挥的作用及其机制并不完全清楚。我们推测AMPK通路可能在pBOO后膀胱功能障碍的发生、发展及失代偿过程中发挥着重要的作用。因此我们在本研究中借助于pBOO动物模型,关注pBOO后膀胱组织内AMPK通路的改变情况,探究AMPK在pBOO后膀胱功能障碍及膀胱重塑中发挥的作用,并试图通过干预AMPK通路延缓pBOO后膀胱结构及功能的损伤。研究目的探究AMPK在pBOO所致的膀胱结构和功能改变过程中的变化,明确AMPK在pBOO后膀胱功能障碍及膀胱重塑中的作用,并试图通过对该通路的干预缓解pBOO后膀胱结构、功能的损伤。研究方法1.建立pBOO大鼠模型选择7周龄雌性SpragueDawley大鼠,麻醉、消毒后将外径0.9mm的无菌金属棒经尿道插入,以此为指引仔细游离膀胱颈并用5-0丝线结扎,在进行打结后取出金属棒并将切口逐层缝合;假手术组大鼠进行相同程序的操作,但不作打结。2.评价动物模型的膀胱功能采用麻醉下膀胱内压力检测评估大鼠膀胱功能,利用生理记录系统记录最大膀胱内压力、膀胱内基线压力、膀胱收缩间隔。同时,记录并计算排尿量、残余尿量、膀胱容量、膀胱顺应性、排尿效率以及无排尿收缩(non-voidingcontraction,NVC)的频率和幅度。3.评价膀胱结构的改变称量膀胱质量;通过HE染色观察膀胱结构的变化;进行Masson染色并根据膀胱组织中肌纤维及胶原纤维的含量评价膀胱重塑水平;通过RT-qPCR、WesternBlot检测促纤维化蛋白的表达。4.探究pBOO大鼠梗阻后早期及晚期的膀胱结构、功能特点建立pBOO大鼠模型后,分别以术后2周、9周作为梗阻后的早期与晚期,按照以上2、3中的方法检测膀胱结构、功能的变化特点;同时检测膀胱组织内IL-6、IL-10、TGF-β1、TNF-α、IL-1β、HIF-1α等的表达,及反映膀胱组织内炎症与氧化应激的指标Evensblue、MDA、SOD、CAT、GSH-Px等。5.探究pBOO大鼠梗阻后膀胱内AMPK的表达及激活情况的改变建立pBOO大鼠模型后,分别以术后2周、9周作为梗阻后的早期与晚期,检测膀胱组织中AMPKα及反映其激活水平的p-AMPKα(Thr183/172)的表达情况。6.探究AMPK激动剂对pBOO大鼠梗阻后早期及晚期的膀胱结构、功能的影响利用AMPK激动剂二甲双胍对pBOO大鼠进行灌胃处理,分别在梗阻后的早期及晚期检测其对膀胱结构、功能及炎症、氧化应激的影响。7.探究AMPK通路抑制梗阻后膀胱重塑的具体机制a.分离提取膀胱原代成纤维细胞、膀胱平滑肌细胞,检测AMPK激动剂对原代细胞的作用;b.探究AMPK/Smad3通路对膀胱原代成纤维细胞促纤维化特征的影响:使用AMPK激动剂二甲双胍、阿卡地新(acadesine,AICAR)处理膀胱原代成纤维细胞并分别检测其对Smad3介导的胶原蛋白合成的影响;c.探究AMPK/自噬通路对膀胱原代成纤维细胞的促纤维化特征的影响:使用AMPK激动剂二甲双胍及AICAR处理膀胱原代成纤维细胞,并检测AMPK激动剂对胶原蛋白表达及自噬的影响;使用晚期自噬抑制剂BafilomycinA1、Ca-5f,并结合靶向AMPKα、LC3B的siRNA,明确AMPK激活的自噬对膀胱成纤维细胞胶原蛋白合成的影响。结果1.pBOO大鼠在梗阻早期、晚期表现为不同的尿动力学特征尿动力学检测显示,与假手术组大鼠相比,建模2周后的pBOO大鼠表现为最大膀胱内压力升高、膀胱内基线压力升高、膀胱收缩间隔延长、残余尿量增加、膀胱容量增加和排尿效率降低,但膀胱顺应性并没有较大改变,NVC也并不明显,提示膀胱功能实现了部分补偿;而建模9周后的pBOO大鼠,尿动力学表现为更差的膀胱功能,除建模2周后的pBOO大鼠表现出的膀胱功能异常外,还出现了膀胱顺应性下降和频繁的NVC。2.大鼠膀胱组织在pBOO早期以炎症表现为主,晚期以纤维化表现为主pBOO建模后2周,HE染色显示膀胱上皮增厚,膀胱组织内炎性细胞浸润增多,Evensblue检测也提示膀胱内血管的通透性增加,反映出膀胱内炎症水平的升高;Masson染色表明逼尿肌增生明显,而膀胱内胶原纤维的含量没有明显变化;尽管此阶段的大鼠膀胱重量增加,但其膀胱仍保持了基本的结构。该阶段大鼠的膀胱组织学特征主要表现为炎症和逼尿肌增生。而在pBOO后9周,Westernblot及Masson染色表明有更多的胶原蛋白合成并沉积在膀胱壁内。但根据Evensblue检测和HE染色结果显示,此阶段的大鼠膀胱壁内炎症不再明显。该阶段大鼠的膀胱组织学特征主要表现为纤维化改变。3.AMPK在pBOO后梗阻的早期活激活增多,晚期激活下降pBOO建模2周后,大鼠膀胱组织内AMPKα及p-AMPKα(Thr183/172)的表达均没有明显降低,其中p-AMPKα(Thr183/172)的水平甚至略有升高。而在pBOO后9周,p-AMPKα(Thr183/172)在膀胱中的表达明显减少。4.AMPK激动剂治疗减轻了梗阻后膀胱内早期出现的炎症和升高的氧化应激水平pBOO大鼠从建模后第3天开始接受AMPK激动剂二甲双胍或等体积饮用水的灌胃处理,在建模2周后进行相关检测。在2周的pBOO大鼠中,HE染色和Evansblue检测显示接受二甲双胍处理的pBOO大鼠膀胱内的炎症浸润得以缓解,且二甲双胍治疗组中大鼠膀胱组织内MDA含量更低而总SOD、GSH-Px、CAT活性也得到一定程度的挽救,同时膀胱组织内IL-6、IL-1β、HIF-1α、TNF-α在mRNA及蛋白水平也均有一定的表达抑制。Westernblot检测显示,相比于未接受药物处理的pBOO大鼠,接受二甲双胍治疗处理的pBOO大鼠膀胱中NLRP3、IL-1β、cleavedcaspase-1、p-NF-κBp65(Ser536)的表达水平相对更低。5.AMPK激动剂治疗对梗阻后早期的膀胱功能障碍缓解不明显pBOO建模2周后,与未接受药物处理的pBOO组大鼠相比,AMPK激动剂二甲双胍处理的pBOO大鼠膀胱内基线压力更低。除此之外,最大膀胱内压力、膀胱收缩间隔、残余尿量、膀胱容量、排尿效率和膀胱顺应性在两组之间并没有较大差别。6.AMPK激动剂长期干预可缓解pBOO大鼠膀胱功能障碍pBOO大鼠从建模后第3天开始接受二甲双胍或等体积饮用水的灌胃处理,在建模9周后进行相关检测。与未接受药物处理的pBOO大鼠相比,接受二甲双胍处理的pBOO大鼠最大膀胱内压力、膀胱内基线压力、残余尿量、膀胱容量、NVC的频率和幅度更低,同时膀胱的顺应性和排尿效率也有一定改善。7.AMPK激动剂长期干预可缓解pBOO继发的膀胱重塑pBOO大鼠从建模后第3天开始接受AMPK激动剂二甲双胍或等体积饮用水的灌胃处理,在建模9周后进行相关检测。与未接受药物处理的pBOO大鼠相比,Masson染色显示二甲双胍处理的pBOO大鼠表现为更轻微的膀胱重塑,Westernblot、RT-qPCR也证实了其膀胱内有更少的胶原蛋白合成与沉积。8.AMPK通路可抑制膀胱成纤维细胞的胶原合成AMPK激动剂二甲双胍、AICAR可以抑制原代膀胱成纤维细胞胶原蛋白的合成,并对TGF-β诱导的胶原蛋白合成增多也有明显的抑制作用,而使用siRNA干扰AMPKα可以增加胶原蛋白在膀胱成纤维细胞内的表达与积累。9.AMPK可通过TGF-β/Smad通路及自噬通路调控膀胱成纤维细胞胶原蛋白的表达AMPK激动剂二甲双胍、AICAR可抑制p-Smad3(Ser423/425)进而减少膀胱成纤维细胞合成胶原蛋白;AMPK激动剂处理还可以通过激活自噬通路促进胶原蛋白合成后的降解;晚期自噬抑制剂CA-5f、BafilomycinA1也可以增加胶原蛋白在膀胱成纤维细胞内的积累。但在使用siAMPKα、siLC3B及晚期自噬抑制剂处理过的成纤维细胞中,AMPK激动剂对胶原蛋白表达的抑制作用并不明显。结论及意义结合pBOO动物模型我们发现,pBOO后膀胱结构、功能的改变是渐进的,pBOO大鼠在梗阻早期和晚期表现为不同的膀胱结构及功能特征。梗阻后早期(建模后2周)膀胱内以炎症浸润增多和氧化应激升高为主要特征,此时AMPK的激活有一定程度的代偿性升高,膀胱的顺应性也在一定程度上实现了代偿;而在梗阻后晚期(建模后9周),膀胱内急性炎症表现不再明显,而是以纤维化改变为主,此时AMPK的激活失代偿,且膀胱功能进一步恶化,膀胱顺应性出现失代偿并伴随着更为明显的NVC。在进一步的实验中我们发现,与未接受药物处理的pBOO大鼠相比,接受AMPK激动剂二甲双胍处理的大鼠在梗阻后早期有着更轻微的炎症表现,而长期服用(9周)二甲双胍治疗的pBOO大鼠的膀胱纤维化水平也在一定程度上得以改善,膀胱的顺应性也得到了部分保护,这提示AMPK对pBOO后大鼠膀胱结构、功能有一定保护作用。膀胱纤维化是pBOO后膀胱损伤不断积累、加重并最终失代偿的结果,也是导致膀胱功能不可逆损害的重要原因。膀胱纤维化最突出的表现是胶原纤维在膀胱壁内的大量沉积,这通常源于膀胱成纤维细胞过度合成、释放的胶原蛋白。我们利用膀胱成纤维细胞的体外实验证实激活AMPK通路可抑制胶原蛋白的合成、释放,而这一作用是通过抑制TGF-β/Smad3通路介导的胶原合成及通过促进胶原蛋白合成后的自噬介导的。我们的研究证实了AMPK通路在pBOO后膀胱结构、功能的损伤与恶化过程中的重要作用。我们证实了AMPK通路的激活可通过抑制梗阻后膀胱内早期的炎症,并通过抑制膀胱成纤维细胞TGF-β/Smad3通路介导的胶原合成及通过促进胶原蛋白合成后的自噬,改善、缓解了pBOO激发的膀胱重塑及功能障碍。我们的研究为pBOO患者延缓梗阻继发的进展性膀胱功能障碍提供了潜在的治疗靶点。本研究的创新点与不足之处我们的研究以pBOO大鼠为模型,分别观察了膀胱组织在梗阻后早期和晚期的不同表现,证实了pBOO后膀胱从炎症到纤维化的演变过程,并发现了AMPK通路的激活在pBOO后早期可能作为一种代偿性机制减轻膀胱内炎症、氧化应激并保护膀胱结构、功能,而随着梗阻时间延长,该机制逐渐失代偿,并与加重的膀胱结构、功能的紊乱密切相关;此外,我们发现激活AMPK通路,可抑制膀胱成纤维细胞合成、释放胶原蛋白,而这一作用是通过抑制TGF-β/Smad3通路介导的胶原合成以及通过促进胶原蛋白合成后的自噬介导的。AMPK激动剂可能是延缓pBOO继发的膀胱结构、功能改变的潜在药物。需要指出的是,受制于临床实际,关于pBOO继发的膀胱结构、功能改变进程的研究无法在临床患者中进行,本课题的研究也主要在动物模型中进行。尽管该模型已广泛地应用于pBOO的研究,但这种模型可能与临床上pBOO患者的发病机制不完全相同,这是本实验的不足之处。