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糖尿病是世界性重大疾病之一。当前中国成年人糖尿病患者数量近1.14亿,是世界上糖尿病患者人数最多的国家,糖尿病在我国的防治形势非常严峻。胰岛β细胞衰竭是糖尿病致病机制的核心环节,促进β细胞再生、恢复患者的β细胞数量和功能是治疗糖尿病的有效策略。胰腺组织中存在具有分化潜能的细胞,如胰腺导管细胞已被证实具有向β细胞分化的能力,相关研究是近年糖尿病热点领域。肠促胰素GLP-1类似物及其降解酶DPP-4抑制剂的研究及临床应用,是近年来新型降糖药物研发的重要成果。GLP-1通过与其受体GLP-1R结合激活下游信号通路实现促进胰岛素分泌等多重生理效应。GLP-1类药物例如Exendin-4(艾塞那肽)在胰岛β细胞再生中的显著作用也已为人们所认知,但其分子调控机制尚不明确。葛根素是传统降糖中药葛根的主要有效成分,临床用于心脑血管疾病治疗。我们前期研究发现葛根素能够作用于GLP-1R通路,通过上调胰岛β细胞GLP-1R的表达水平激活下游通路,促进β细胞的增值。而葛根素是否也具有调控胰岛β细胞分化再生的潜在功效,同样是我们拟探讨并揭示的研究目标。本课题在分子、细胞及整体动物三个层次,考察了Exendin-4及葛根素促进GLP-1R通路介导的胰腺导管上皮细胞向β细胞分化再生的作用,并初步探讨其分子调控机制。主要研究内容与结果如下:1.Exendin-4体外诱导小鼠胰腺导管细胞分化的作用与机制研究实验采用Exendin-4(Ex4)诱导分离培养的小鼠胰腺导管细胞分化,可观察到明显的insulin染色阳性的CK19+导管细胞,及胰岛样结构的形成。我们也观察到介导胰腺导管细胞分化的重要转录因子如Ngn3,Pdx-1,Maf-A在导管细胞中的表达,验证了Ex4诱导小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化的作用。我们采用GLP-1R拮抗剂Exendin(9-39),Wnt通路β-catenin转录抑制剂ICG001,及JAK2抑制剂AG490,探讨调控此过程的作用机制。荧光染色结果表明,Exendin(9-39)及ICG001能够有效抑制insulin和Pdx-1的表达,而AG490仅表现出部分抑制作用。RT-PCR实验同样证实,Exendin(9-39)及ICG001能够有效抑制insulin,Pdx-1及Ngn3的mRNA水平的升高,而AG490仅能够部分阻断其上调。进一步,我们检测了相应通路蛋白分子的变化。AKT作为最重要的GLP-1R信号通路下游分子之一被Ex4激活,p-AKT水平显著升高,Exendin(9-39)有效阻断AKT的激活,ICG001抑制作用较弱一些,而AG490无明显作用。当考察Wnt通路,发现Ex4上调TCF7L2的表达,且Ex4能够促进β-catenin由胞质向胞核的转位,这表明Ex4能够有效激活经典Wnt通路,Exendin(9-39)能够抑制这些效应,而ICG001和AG490无明显作用。我们同样观察到Ex4对JAK2/STAT3通路的激活效应,p-JAK2与p-STAT3的水平都显著增加,而Exendin(9-39)对其的抑制作用要弱于ICG001与AG490。2.在高脂诱导的HFD(high-fat diet)糖尿病小鼠模型中,考察Exendin-4促小鼠胰腺导管细胞分化的作用Ex4连续给药2周后,HFD小鼠糖尿病症状得到显著改善。在Ex4组小鼠胰腺导管细胞中检测到多处insulin的阳性表达。同时,Ex4也有效诱导Pdx1及Ngn3在导管细胞中的表达,表明胰腺导管细胞出现了向胰岛β细胞结构的分化,进一步证实了我们体外细胞实验中Ex4能够诱导胰腺导管细胞分化再生为胰岛β细胞的结论。3.葛根素诱导小鼠胰腺导管细胞分化的初步探索性研究首先我们在细胞水平考察了葛根素诱导胰腺细胞分化的作用。在分离培养的小鼠胰腺导管细胞中,我们观察到葛根素能够诱导insulin与Pdx1在导管细胞中的表达,并且,葛根素与Exendin-4联合给药,其诱导效应显著增强,提示其效应与GLP-1R通路激活相关。我们在HFD糖尿病小鼠模型中进一步验证葛根素的作用。在葛根素组小鼠胰腺导管细胞中检测到多处insulin的阳性表达,葛根素也能够诱导Pdx1及Ngn3在导管细胞中的表达,而GLP-1R拮抗剂Exendin(9-39)显著抑制了葛根素的诱导作用,表明葛根素促胰腺导管细胞分化作用依赖于GLP-1R通路的激活。综上所述,我们通过Ex4的体内外效应研究,阐明GLP-1R通路,Wnt通路,JAK2/STAT3信号通路协同调控GLP-1R介导的腺导管细胞分化过程,揭示了调控β细胞分化再生的重要分子,为今后2型糖尿病干预、防治潜在新靶点的发现奠定实验基础。同时,我们开展了降糖中药活性成分葛根素促胰岛β细胞再生的拓展性研究。证实了葛根素体内外诱导胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化再生的新功效,并初步验证其作用依赖于GLP-1R通路,为今后相关研究的深入开展提供支撑,也有助于拓展降糖中药药物研发新思路。