双光子激发荧光成像是通过将荧光团的激发和发射限制在显微镜的焦平面上,通过从较厚的散射样本的深处提供较薄的光学部分。与单光子共聚焦显微镜相比,双光子激发显微镜在空间限制方面具有很多优势。首先,它会增加激发光的穿透深度;第二,由于其不会产生离焦荧光,因此在显微镜的检测路径上不需要针孔,所以会改善荧光收集效率。最重要的是,双光子激发能够有效的降低整体光损伤和光漂白,以至于在长期成像过程中延长了生物标本的生存能力。在此,我们构建了具有双光子荧光性质的探针用于检测活细胞,组织和活体中的羧酸酯酶2。羧酸酯酶2(CES2)作为水解含酯,酰胺,氨基甲酸酯和硫酯的物质的必需酶之一,在细胞中起着重要作用。在这项工作中,我们建立了一个近红外双光子荧光探针,以高选择性和高灵敏度检测内源性CES2。与CES2反应后,探针DCMCES2释放出荧光团DCM,同时提供以685 nm为中心的特征荧光峰。实验结果表明,探针DCM-CES2具有125 nm的较大的斯托克斯位移和低达0.087μg/mL的检测限(LOD),而且探针DCM-CES2在10分钟内对CES2有一个快速而特异性的响应。经过细胞毒性测试(CCK-8),探针DCM-CES2具有低细胞毒性和优异的组织穿透能力,可用于评估CES2在活细胞,癌症组织和结肠癌小鼠模型中的羧酸酯酶2的实时活性,并且具有较低的背景干扰。之后我们将DCM-CES2用于检测抗癌前药(例如伊立替康(CPT-11)和卡培他滨(CAPE))在治疗结肠癌细胞过程中引起的CES2的活性变化。最后我们将探针用于患有结肠癌的小鼠中,观察在抗癌药物伊利替康治疗过程中羧酸酯酶的变化情况。结果表明,此探针还可作为有效的化学工具,专门研究CES2实时活性的变化。因此,DCM-CES2可以作为对CES2进行特定研究的有效工具,同时还能引导与CES2相关的病理和生理过程。