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肝细胞癌(简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一,发病隐匿,明确诊断时多是中晚期,早期诊断和早期治疗对临床治疗有极其重要的意义。肝癌发生的分子机制至今尚未明了。dlk1基因作为近几年新发现的与肝癌发生相关的基因引起了人们广泛的关注。然而,dlk1基因在肝癌的发生发展中所起的作用还不是很清楚。因此,我们利用肝癌及癌周肝硬化两种细胞株研究dlk1基因的表达以及抑制其表达后对两种细胞株生长成瘤的影响,从而探讨dlk1基因在肝癌发生发展中的作用。第一部分dlk1shRNA质粒表达载体的构建目的：构建针对人dlk1基因的shRNA及其质粒表达载体。方法：设计针对人dlk1基因序列的4组寡核苷酸链模板,退火后与载体质粒pGPU6/GFP/Neo连接,然后进行DNA序列鉴定。结果：DNA测序分析后,表明靶向dlk1的RNA干扰质粒载体构建成功。结论：成功构建针对人dlk1基因的shRNA重组表达质粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA-dlk1。第二部分RNA干扰对人肝细胞癌(QGY-7703)及癌周肝硬化(QSG-7701)细胞株dlkl基因沉默作用的研究目的：将干扰质粒转染人肝细胞癌及癌周肝硬化细胞株,观察其对dlkl基因沉默的效果。筛选出干扰效果最好的质粒并建立稳定转染细胞株。方法：1.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达。2.干扰质粒分别转染肝细胞癌和癌周肝硬化细胞株,分别采用实时荧光定量PCR和Western印迹方法检测dlkl mRNA和蛋白表达情况,筛选出抑制靶基因表达效果最好的质粒。3.将干扰效率最高的表达质粒用来建立稳转细胞株。同时用NC(negative control)表达质粒作为阴性对照稳转细胞株。经G418筛选,对两种细胞株分别建立两个稳转细胞株,分别称为QGY-7703-522、QGY-7703-NC和QSG-7701-522. QSG-7701-NC。4.采用实时荧光定量PCR和Western Blot再次检测稳定转染细胞株的dlk1mRNA和蛋白的表达变化情况,确认稳定转染细胞株中基因表达的干扰效果。结果：1.干扰质粒转染肝细胞癌和癌周肝硬化细胞株后,实时荧光定量PCR检测显示,shRNA-522、shRNA-1052、shRNA-1171和shRNA-1233干扰质粒对两种细胞的靶基因mRNA表达都有抑制作用,在两种细胞中shRNA-522干扰质粒抑制作用均为最明显。在QGY-7703细胞中抑制率为69%,在QSG-7701细胞中抑制率为72%。与空白和阴性对照组相比,抑制率明显(P<0.05)；Western blot方法检测各组细胞中蛋白表达水平显示,shRNA-522、shRNA-1052、shRNA-1171和shRNA-1233干扰质粒对两种细胞靶基因蛋白表达均有抑制作用,其中shRNA-522干扰质粒抑制作用最明显,抑制率在QGY-7703细胞中为77%,在QSG-7701细胞中为80%,与空白和阴性对照组相比,抑制率明显(P<0.05)。可见shRNA-522干扰质粒对dlkl基因表达抑制最明显。2.每种细胞株成功筛选出分别表达shRNA-522和shRNA-NC质粒的稳转细胞株,分别命名为QGY-7703-522、QGY-7703-NC、QSG-7701-522、QSG-7701-NC。3.实时荧光定量PCR及Western blot对稳定细胞株再次检测显示,与阴性稳转细胞株和空白组相比较,在QGY-7703细胞中干扰效率83%,在QSG-7701细胞中干扰效率为86%。结论：1.shRNA-522干扰质粒可以明显抑制人肝细胞癌及癌周肝硬化细胞株dlkl基因mRNA和蛋白的表达。2.成功构建稳定转染的细胞株。第三部分RNA干扰dlkl的表达对肝细胞癌(QGY-7703)及癌周肝硬化(QSG-7701)细胞株生物学行为的影响目的：研究dlk1shRNA对肝细胞癌及癌周肝硬化细胞株体外生长、凋亡、迁移侵袭能力的影响。方法：用成功构建的稳定转染的细胞株QGY-7703-522、QSG-7701-522为研究对象,以QGY-7703-NC、QSG-7701-NC和未转染的细胞分别为对照。细胞流式实验细胞周期和凋亡,CCK8法绘制细胞的生长曲线比较生长差异,集落实验和Transwell小室检测细胞体外克隆及侵袭力的能力。结果：QGY-7703细胞株中未转染的细胞、阴性对照组细胞的各项指标比较无明显差异。与对照组的细胞比较,实验组QGY-7703-522的细胞生长明显缓慢,从第三天开始生长速度明显低于另外两组,至对数生长期更明显。QGY-7703-522组细胞的克隆形成率明显低于对照组(P<0.05)。QGY-7703-522组细胞穿过Matrigel滤膜的细胞数明显低于对照组(P<0.05)。QSG-7701细胞株中实验组细胞的生长速度和克隆形成率与阴性对照组和空白对照组比较均降低(P<0.05),阴性对照组和空白对照组比较无差异(P>0.05)。流式细胞仪检测细胞周期结果显示：QGY-7703-522细胞株Go/G1期细胞比率升高,与QGY-7703-BLANK组和QGY-7703-NC组相比有差异(p<0.05)；QGY-7703-BLANK组和QGY-7703-NC组相比P>0.05；S和G2/M期比率降低(P<0.05),QGY-7703-BLANK组和QGY-7703-NC组细胞的周期末出现上述变化(P>0.05)。QSG-7701-522细胞株Go/G1期细胞比率升高,与QSG-7701-BLANK组和QSG-7701-NC组相比有差异p<0.05;QSG-7701-BLANK组和QSG-7701-NC组相比,无明显区别(p<0.05),S和G2/M期比率降低(P<0.05), QSG-7701-BLANK组和QSG-7701-NC组细胞的周期末出现上述变化(P>0.05)。结论：shRNA-522干扰质粒稳定转染可抑制肝细胞癌及癌周肝硬化细胞株的体外生长及迁移侵袭能力。第四部分RNA干扰沉默dlkl基因对人肝细胞癌(QGY-7703)及癌周肝硬化(QSG-7701)细胞株裸鼠皮下移植瘤的实验研究目的：建立裸鼠皮下人肝细胞癌及癌周肝硬化细胞株种植瘤模型,研究dlkl基因沉默对两组细胞株裸鼠成瘤的影响。方法：肝癌细胞株：QGY-7703-BLANK、QGY-7703-NC、QGY-7703-522,癌周肝硬化细胞株：QSG-7701-BLANK、QSG-7701-NC、QSG-7701-522、。分别接种于裸鼠皮下,观察种植瘤的生长情况,见成瘤后每5天测量瘤体组织体积并对裸鼠称重。6周后处死裸鼠并测瘤体重量,免疫组化检测肿瘤组织DLK1蛋白表达。结果：两组细胞株的实验组肿瘤生长速度均慢于其对照组(P<0.05),实验结束时实验组瘤体组织的体积与瘤重与对应的对照组比较均明显降低(P<0.05),免疫组化证实两种细胞株的实验组肿瘤组织DLK1蛋白表达与对应的对照组比较均降低(p<0.05)。结论：沉默dlkl可以抑制肝细胞癌及癌周肝硬化细胞移植瘤的生长。