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论文研究目的是探索使获得的抑制凝血因子Ⅷ血管内皮细胞,生长在促进其改性的丝素膜上,使血管支架材料不仅能内皮化,而且能减少凝血因子Ⅷ分泌,达到双重抗凝血的功效,这是一种探索性的研究.为此,工作主要作了以下几个方面的研究.1.提取合格的丝素溶液,用的碳酸钠和氯化钙等配置溶液,抽提家蚕蚕茧,制得脱胶丝素溶液.对丝素溶液用2-巯基乙醇还原,切断其由二硫键连接的亚基,用SephadexG-200柱,层析还原丝素溶液,显示两个峰,说明丝素由两亚基组成.用电泳7.5％SDS-PAGE检测丝素及亚基的分子量,测得丝素分子量约为335KD,还原后的亚基分子量分别为310KD,25KD,说明丝素是由大亚基和小亚基组成.用氨基酸自动分析仪对丝素蛋白和其大小亚基进行氨基酸组分测定.氨基酸的数据显示,它们主要是由三种主要简单氨基酸Gly、Ala、Ser组成,与报道丝素蛋白氨基酸级分相符合,其中丝素及其大小亚基的复杂氨基酸(如Lys,His,Arg)含量都较少,从大小亚基的数据可看出,小亚基的复杂氨基酸大于大亚基,与文献报到相符.用丝素溶液制成不溶于水的丝素膜,对丝素膜的二级结构进行红外光谱吸收测定,属于无规则线圈、α螺旋、反向平行β-折叠.从上述各项实验提取的丝素溶液是成功的,可在随后的研究中应用.2.RGD的抗体IgG的研制,是要利用RGD的抗体IgG.由于RGD不具有免疫原性,只具备和其抗体IgG的特异性结合,不具备在动物体内产生的抗体IgG,为了解决这一问题,需要制备出RGD免疫原,在动物体内诱发出RGD的抗体IgG.研究应用双功能偶联剂小分子间苯二甲基二异氰酸盐m-xylylen-diisocyanate作桥梁,将短肽GLY-ARG-ASP-SER-PRO-LYS粘附生长因子偶联到卵清白蛋白Ovalbumin载体上,对偶联物RGD-OVA经SDS-聚丙烯酰胺凝胶纯化和紫外光谱测定,确定RGD与OVA偶联比为11:1符合小分子和载体连接产生抗体的比例.用此偶联物对兔子进行背部小剂量多点免疫注射,诱发出了RGD的抗体IgG.3.对丝素膜进行生物改性.制膜作为血管细胞内皮化支架,用SPA蛋白(Staphylococcal protein A,简称A蛋白或SPA)和丝素溶液混溶杂化成膜,并用乙醇固定丝素膜中SPA,称这种膜为SPA丝素膜.然后利用SPA丝素膜表面露出SPA结合抗体IgG的位点,结合RGD的抗体IgG,然后再将短肽粘附生长因子RGD结合到吸附有IgG的SPA丝素膜表面,称这种利用生物吸附力改性的丝素膜为生物改性的RGD-IgG-SPA丝素膜.对这种生物改性SPA丝素膜进行以下测试以初步确定膜的可行性.首先构建人工合成的部分反义核酸ⅧC(以pⅧC表示)真核表达载体,用人工合成pⅧC引物,经退火、延伸和PCR扩增合成部分反义核酸ⅧC.经酶切插入原核质粒序列pUC19合成,转化大肠杆菌JM103,得到进一步可克隆和繁殖pⅧC的原核质粒的大肠杆菌JM103.然后再将插入pUC19人工合成反义核酸片段pⅧC酶切后,再插入真核表达载体pXJ41-neo,得到重组pXJ41-neo/pⅧC,经原位杂交鉴定和荧光标记法测序,证明插入真核表达载体pXJ41-neo的方向和序列是正确的.用构建含有部分反义凝血因子基因片段的真核表达质粒pXJ41-neo/pⅧC,由磷酸钙介导转染血管内皮细胞,用新霉素筛选出阳性克隆血管内皮细胞,经20代稳定繁殖后,获得转基因细胞.5.研究了RGD-IgG-SPA丝素膜的生物改性体外内皮化效果和其转基因细胞抑制凝血因子Ⅷ效果.