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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的严重危害母猪和仔猪的1种传染性疾病。该病毒属于动脉炎病毒科,为有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组共有9个开放阅读框（Open reading frame, ORF）。ORF1（ORF1a和ORF1b）翻译出与病毒的复制与转录有关的多聚蛋白pp1a和pp1ab,ORF2a、ORF3-5编码病毒的糖基化膜蛋白GP2a、GP3、GP4和GP5,ORF2b和ORF6编码病毒的非糖基化膜蛋白E和M,ORF7编码病毒的核衣壳蛋白N,其中pp1a和pp1ab被病毒自身编码的蛋白水解酶切割成14个非结构蛋白（Non-structural protein, Nsp）,Nsp4具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,使用保守的His39-Asp64-Ser118作为催化3联体,负责把pp1a和pp1ab水解成多个非结构蛋白（Nsp3-12）。这些Nsps共同组成病毒的复制酶与转录酶复合体（Replicase and transcriptase complex, RTC）来完成病毒的复制和增殖。为了研究不同致病性PRRSV毒株Nsp4的酶动力学差异,本研究将PRRSV HuN4株Nsp4和CH-1a株Nsp4的基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组表达质粒HuN4-pGEX和CH-1a-pGEX , SDS-PAGE分析表明重组质粒在大肠杆菌系统中获得了正确表达。经Glutathione-Sepharose 4B蛋白纯化柱纯化获得了高纯度的重组蛋白Nsp4。Western Blot分析显示2个毒株的Nsp4能够被PRRSV阳性猪血清特异性识别,表明蛋白具有良好的反应原性。利用合成的人工短肽Dabcyl-KTAYFQLE↓GRHFE-Edans作为底物（含Nsp11-12连接位点）,通过仪器检测Nsp4切割底物产生荧光值的变化研究2个蛋白的酶动力学,结果显示2蛋白酶体外能够切割人工短肽,HuN4株Nsp4的Km=0.1431±0.009718 mM,Kcat=0.2126±0.000569 min-1;CH-1a株Nsp4的Km=0.1170±0.009223 mM,Kcat=0.3323±0.009672 min-1。说明体外水解Nsp11-12时,CH-1a株Nsp4的催化效率显著高于HuN4的（p<0.05）。为了研究HuN4株和CH-1a株编码Nsp4基因的表达情况,本研究针对PRRSV编码Nsp4的核苷酸序列设计特异性引物和Taq Man荧光探针,建立了可以快速检测PRRSV的荧光定量方法。该方法在检测101～108拷贝/μL模板范围内有良好线性关系,能检测10拷贝/μL的模板;而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒和伪狂犬病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为0.81%～1.36%,批间变异系数为1.77%～2.56%。表明该方法具有特异、敏感和稳定等优点。利用该方法研究HuN4株和CH-1a株Nsp4基因的mRNA在体外细胞的动态表达情况,通过2种毒株体外感染Marc-145细胞和猪肺泡巨噬细胞（PAM）,并于不同时间点收毒,荧光定量检测所收细胞Nsp4 mRNA拷贝数。结果显示接毒后12 h～96 h,Marc-145细胞上,HuN4 Nsp4 mRNA拷贝数是CH-1a的101.06～1.14倍;PAM上,HuN4 Nsp4 mRNA拷贝数是CH-1a的101.21～1.36)倍。表明不论是在Marc-145细胞还是在PAM上,HuN4株在接毒后12 h～96 h间mRNA拷贝数明显高于CH-1a株（p<0.01）。通过以上研究得出由于HuN4株Nsp4基因的转录水平显著高于CH-1a Nsp4的切割效率,进而导致体外HuN4的增殖速度快于CH-1a的。