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背景和目的胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,多数患者被发现时已处中晚期,失去了手术治疗的最佳时机,只能进行保守治疗,而保守治疗的效果往往不能令人满意,其原因是多方面的,但肿瘤细胞凋亡机制异常引起的凋亡抵抗被认为是对化疗、放疗药物不敏感的重要因素,因此从凋亡异常的发生机制着手,寻找逆转胃癌细胞凋亡抵抗的靶点将会成为胃癌治疗的新的研究方向。有研究表明,凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族是独立于Bcl-2的细胞内抗凋亡蛋白家族,包括多种蛋白,其中livin是一种新发现的凋亡蛋白抑制基因成员,它们在凋亡的调节中扮演着重要的角色。研究表明,肿瘤细胞中的IAP表达往往上调,通过阻断或拮抗IAP的功能重新恢复恶性肿瘤(包括胃癌)对凋亡刺激剂(包括化疗药物)的敏感性,因此如果能够抑制livin基因在肿瘤细胞中的表达,将会恢复肿瘤细胞对凋亡的敏感性,大大提高肿瘤的治疗效果。目前国内外关于Livin的研究较少,且有资料显示Livin与肿瘤的发生发展相关。胃癌是我国常见的恶性肿瘤,Livin基因在胃癌的中所扮演的角色国内外研究亦不多,值得我们深入研究。RNAi(RNA interference)技术是近年发展起来的基因沉默技术,能够利用双链RNA(dSRNA)特异性地降解与其同源的mRNA序列,阻断相应基因的表达。并且能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达,产生类似基因敲除的效应。因此探讨小干扰RNA(siRNA)对胃癌细胞livin基因表达的基因沉默(genesilencing)作用,有望为胃癌的治疗提供一种新的思路和方法。为此,本研究通过自行设计了靶向沉默Livin的siRNA真核表达载体,转染至胃癌细胞株BCG-823中来抑制Livin的表达,然后检测转染前后胃癌BCG-828细胞的增值能力及凋亡敏感性的变化,观察siRNA对胃癌BGC-823细胞株livin基因的表达影响,以探讨siRNA在肿瘤细胞生长、凋亡中的作用,为探索siRNA沉默livin基因抑制胃癌的发病机制和临床治疗提供新的思路和理论依据。方法1.利用Takara、Ambion和PromegasiRNA靶序列分析设计系统,扫描人livin(livinα和livinβ)cDNA编码序列,依据siRNA靶序列设计原则,经BLAST同源性分析选择确定19个碱基的siRNA靶序列,同时随机组合出一条对照序列。设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向livin基因的寡核苷酸,再退火,克隆到经限制性核酸内切酶酶切后的siRNA表达载体启动子的下游,重组构建RNAi质粒同时设立非特异性对照,干扰载体用限制性核酸内切酶酶切和测序鉴定。2.脂质体介导siRNA转染胃癌细胞株BGC-823后用G418筛选建立稳定细胞系;观察细胞形态,采用半定量RT-PCR检测不同实验组细胞BGC-823 mRNA水平,比较不同组别的mRNA水平。3.用四氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖凋亡;荧光显微镜观察siRNA转染BGC-823细胞数,并计算其转染绿。结果1.通过同源序列检索和进一步优选,确定了19个碱基为siRNA靶序列:GCGTCTGGCCTCCTTCTAT(440～458)和GTCTGGCCTCCTTCTATGA(442～460)。2.siRNA发卡DNA的退火后,电泳可见明亮条带,均位于约100bp处,与设计完全一致。3.对胃癌细胞株BGC-823真核表达载体的构建进行酶切和序列分析,发现酶切图谱及插入序列与预期结果一致。4.转染siRNA组Livinα/βmRNA(0.11±0.07,0.13±0.04)表达明显低于空白对照组(0.37±0.10,0.43±0.09)和空siRNA载体组(0.34±0.08,0.45±0.11,P＜0.05)。5.空白对照组与空siRNA载体组相比,24h、48h、96h和1周时细胞生长未受影响;siRNA组在转染后24h和48h细胞生长也未受影响,但在96h和1周时则被明显抑制(P＜0.01)。6.转染siRNA组的细胞的凋亡率(14.85±1.35)明显高于空白对照组(4.51±0.36)和转染空siRNA载体组(5.13±0.71),两组差异有显著性(P＜0.05)。结论1.成功构建出针对livin的siRNA表达载体。2.靶向siRNA表达载体转染胃癌细胞后能显著降低livin基因的表达。3.Livin基因与肿瘤细胞的增殖和凋亡密切相关,siRNA沉默livin基因能抑制胃癌细胞的生长,促进胃癌细胞的凋亡,提示livin基因有可能成为胃癌治疗的新靶点。