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背景 嵌合抗原受体修饰T细胞(chimeric antigen receptor modified T cells,CAR-T)疗法因其临床试验的确凿疗效,已经成为肿瘤免疫治疗的热点手段之一。在 CARs的基本结构中,以单链抗体(single chain variable fragment, scFv)为代表的胞外抗原识别结构域与 CD3ζ 链的胞内信号段连接,以诱导抗原结合后的 T 细胞激活。为了进一步提高CARs功效,其结构不断优化,设计出第二、三、四代CARs。 人表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor-3, HER3)是HER家族成员之一,与其他HER家族成员不同,HER3本身无受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)活性,但可仍然可以与其他HER受体异二聚化。在许多肿瘤中,HER3作为RTK和PI3K激活之间的主要连接分子,参与肿瘤生长和实体瘤表型维持。另外,HER3作为HER2的共受体,参与乳腺癌扩增并与乳腺癌对靶向HER2的治疗耐药有关。鉴于其在肿瘤中的过表达以及HER信号传导中的代偿作用,HER3逐渐成为肿瘤免疫治疗领域的研究热点。Heregulin(HRG)作为 HER3/4 的配体,通过EGF样结构域与HER3/4受体结合,并诱导构象变化,然后使之与HER受体家族成员之间的异源二聚化,活化下游信号通路,进而导致肿瘤细胞的持续扩增和侵袭。其中HRG1的β亚型由于其更高的受体亲和力,被认为是HER3/4阳性肿瘤中生长增殖主要因子。 目的 除scFv外,天然配体与受体拥有最为合适的亲和力和最小的免疫原性,也可以用来作为CAR的胞外区。本课题设计一种包含天然配体HRG1β胞外结构域的第二代CAR,并在HER3阳性乳腺癌细胞系及裸鼠移植瘤模型中验证其抗肿瘤活性,为HER家族诱发的乳腺癌及 HER2靶向治疗耐药提供新的治疗策略。 方法 应用分子克隆技术构建携带 CAR 基因的慢病毒表达载体,通过流式细胞术及Western blot方法验证CAR基因表达。磁珠分选获得T细胞,并以慢病毒感染方式制备HRG1β-CAR-T细胞。 应用流式细胞术检测细胞表面靶分子表达,CFSE/PI双标法检测CAR-T体外杀伤效果,ELISA法检测细胞因子IL-2、IFN-γ分泌水平。采用siRNAs转染靶细胞,通过qRT-PCR及Western blot方法检测靶基因HER3分子及蛋白水平敲减效果。 选用 HER3 阳性的乳腺癌细胞 SK-BR-3 建立裸鼠移植瘤模型,输注HRG1β-CAR-T细胞或对照T细胞治疗,观察肿瘤体积变化及裸鼠生存期。肿瘤组织制备石蜡切片,通过免疫组织化学染色检测肿瘤组织中T细胞浸润情况。 结果 成功构建携带HRG1β-CAR基因的慢病毒表达载体,并证实CAR基因表达。获得高纯度和一定激活水平的T细胞,并以慢病毒感染方式获得HRG1β-CAR-T细胞。 体外实验结果显示,HRG1β-CAR-T 细胞能够靶向杀伤 HER3 阳性乳腺癌细胞SK-BR-3和BT-474,同时分泌高水平的细胞因子IL-2及IFN-γ;这种CAR-T细胞对HER3分子下调的肿瘤细胞和HER3阴性的肿瘤细胞和正常细胞没有明显杀伤作用。 体内实验结果显示 HRG1β-CAR-T 细胞治疗能够显著遏制荷瘤裸鼠肿瘤生长,延长荷瘤裸鼠的生存期。通过免疫组织化学染色发现,CAR-T 细胞治疗组肿瘤组织可检测到CD3阳性的人T细胞,提示CAR-T细胞可以浸润到肿瘤部位,更好的发挥杀伤功能。 结论 我们成功构建 HRG1β-CAR 并获得HRG1β-CAR-T细胞;该细胞在体外能够特 异性识别并杀伤HER3阳性的乳腺癌细胞SK-BR-3和BT-474,并能在体内显著遏制SK-BR-3移植肿瘤的生长。综上所述,基于HRG1β的CAR-T细胞能有效抑制HER3阳性乳腺癌,由于HER家族成员通过形成异源二聚体发挥作用,这种CAR-T细胞有望为HER2靶向耐药的乳腺癌治疗提供新的途径。