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背景 嵌合抗原受体修饰T细胞（chimeric antigen receptor modified T cells，CAR-T）疗法因其临床试验的确凿疗效，已经成为肿瘤免疫治疗的热点手段之一。在 CARs的基本结构中，以单链抗体（single chain variable fragment, scFv）为代表的胞外抗原识别结构域与 CD3ζ 链的胞内信号段连接，以诱导抗原结合后的 T 细胞激活。为了进一步提高CARs功效，其结构不断优化，设计出第二、三、四代CARs。 人表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor-3, HER3）是HER家族成员之一，与其他HER家族成员不同，HER3本身无受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases, RTKs）活性，但可仍然可以与其他HER受体异二聚化。在许多肿瘤中，HER3作为RTK和PI3K激活之间的主要连接分子，参与肿瘤生长和实体瘤表型维持。另外，HER3作为HER2的共受体，参与乳腺癌扩增并与乳腺癌对靶向HER2的治疗耐药有关。鉴于其在肿瘤中的过表达以及HER信号传导中的代偿作用，HER3逐渐成为肿瘤免疫治疗领域的研究热点。Heregulin（HRG）作为 HER3/4 的配体，通过EGF样结构域与HER3/4受体结合，并诱导构象变化，然后使之与HER受体家族成员之间的异源二聚化，活化下游信号通路，进而导致肿瘤细胞的持续扩增和侵袭。其中HRG1的β亚型由于其更高的受体亲和力，被认为是HER3/4阳性肿瘤中生长增殖主要因子。 目的 除scFv外，天然配体与受体拥有最为合适的亲和力和最小的免疫原性，也可以用来作为CAR的胞外区。本课题设计一种包含天然配体HRG1β胞外结构域的第二代CAR，并在HER3阳性乳腺癌细胞系及裸鼠移植瘤模型中验证其抗肿瘤活性，为HER家族诱发的乳腺癌及 HER2靶向治疗耐药提供新的治疗策略。 方法 应用分子克隆技术构建携带 CAR 基因的慢病毒表达载体，通过流式细胞术及Western blot方法验证CAR基因表达。磁珠分选获得T细胞，并以慢病毒感染方式制备HRG1β-CAR-T细胞。 应用流式细胞术检测细胞表面靶分子表达，CFSE/PI双标法检测CAR-T体外杀伤效果，ELISA法检测细胞因子IL-2、IFN-γ分泌水平。采用siRNAs转染靶细胞，通过qRT-PCR及Western blot方法检测靶基因HER3分子及蛋白水平敲减效果。 选用 HER3 阳性的乳腺癌细胞 SK-BR-3 建立裸鼠移植瘤模型，输注HRG1β-CAR-T细胞或对照T细胞治疗，观察肿瘤体积变化及裸鼠生存期。肿瘤组织制备石蜡切片，通过免疫组织化学染色检测肿瘤组织中T细胞浸润情况。 结果 成功构建携带HRG1β-CAR基因的慢病毒表达载体，并证实CAR基因表达。获得高纯度和一定激活水平的T细胞，并以慢病毒感染方式获得HRG1β-CAR-T细胞。 体外实验结果显示，HRG1β-CAR-T 细胞能够靶向杀伤 HER3 阳性乳腺癌细胞SK-BR-3和BT-474，同时分泌高水平的细胞因子IL-2及IFN-γ；这种CAR-T细胞对HER3分子下调的肿瘤细胞和HER3阴性的肿瘤细胞和正常细胞没有明显杀伤作用。 体内实验结果显示 HRG1β-CAR-T 细胞治疗能够显著遏制荷瘤裸鼠肿瘤生长，延长荷瘤裸鼠的生存期。通过免疫组织化学染色发现，CAR-T 细胞治疗组肿瘤组织可检测到CD3阳性的人T细胞，提示CAR-T细胞可以浸润到肿瘤部位，更好的发挥杀伤功能。 结论 我们成功构建 HRG1β-CAR 并获得HRG1β-CAR-T细胞；该细胞在体外能够特 异性识别并杀伤HER3阳性的乳腺癌细胞SK-BR-3和BT-474，并能在体内显著遏制SK-BR-3移植肿瘤的生长。综上所述，基于HRG1β的CAR-T细胞能有效抑制HER3阳性乳腺癌，由于HER家族成员通过形成异源二聚体发挥作用，这种CAR-T细胞有望为HER2靶向耐药的乳腺癌治疗提供新的途径。